電壓門控型鈉通道中介的單核-巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)在心肌缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、研究目的:炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷后的組織修復(fù)和心室重塑中發(fā)揮重要作用。抑制過度的炎癥反應(yīng)能夠縮小心梗面積，改善心功能。單核/巨噬細胞是心肌組織損傷修復(fù)中駐留時間最長的炎癥細胞。單核/巨噬細胞具有異質(zhì)性:具有促炎癥表型的細胞主要執(zhí)行吞噬、趨化等作用;具有抑制炎癥表型的細胞則能促進血管新生、膠原沉積和組織重塑。近年來的研究顯示，促進單核/巨噬細胞由促炎癥表型向分泌表型轉(zhuǎn)化，將有助于加

2、速組織修復(fù)。新近有研究顯示，單核/巨噬細胞的電壓門控型鈉通道(voltage-gatedsodiumchannels，VGSCs/NaV)參與其生物表型的轉(zhuǎn)化。本實驗室的前期工作發(fā)現(xiàn)VGSCs阻斷劑苯妥英鈉(phenytoin，PHT)可促進巨噬細胞的旁分泌效應(yīng)，并加速心肌梗死(myocardialinfarction，MI)后組織修復(fù)進程，提示VGSCs是調(diào)節(jié)單核/巨噬細胞生物表型的靶點之一。VGSCs在體內(nèi)分布廣泛，如神經(jīng)系統(tǒng)、心肌

3、細胞和骨骼肌細胞。脂質(zhì)體是一種在藥劑學(xué)和分子生物學(xué)研究中常用的藥物/基因載體。經(jīng)靜脈注射的脂質(zhì)體進入血液循環(huán)后，能在調(diào)理素的介導(dǎo)下被單核/巨噬細胞吞噬，且易在炎癥區(qū)域富集，利用這一作用可以實現(xiàn)單核/巨噬細胞的靶向性給藥。本課題的研究目的是探討VGSCs阻斷劑和激動劑對單核/巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化的影響，及脂質(zhì)體包被的PHT對I/R損傷后組織修復(fù)和心室重塑的干預(yù)作用。
　　 研究內(nèi)容與方法:研究內(nèi)容分為細胞實驗和動物實驗兩部分。細胞實驗

4、:以小鼠RAW264.7巨噬細胞系及Wistar大鼠腹腔巨噬細胞為研究對象。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)檢測巨噬細胞內(nèi)VGSCs的表達情況，及將VGSCs阻斷劑PHT、河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)和激動劑藜蘆定(veratridine)作用于不同活化狀態(tài)的巨噬細胞后表型標(biāo)志物mRNA水平的表達情況。應(yīng)用PCR和Westernblot方法檢測NF-κB信號通路的mRNA水平及

5、蛋白水平的表達情況。將RNA干擾(RNAinterference，RNAi)質(zhì)粒（pGPU6/Neo-NaV1.9-shRNA）轉(zhuǎn)染進RAW264.7，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定細胞株。對穩(wěn)定細胞株進行如下檢測:PCR鑒定干擾效率;CCK-8法測定增殖活性;流式細胞術(shù)檢測細胞周期及吞噬能力;transwell小室法檢測細胞的遷移功能;PCR檢測巨噬細胞標(biāo)志物的mRNA水平的表達情況。動物實驗:以雄性Wistar大鼠為研究對象。薄膜分散法制備

6、PHT脂質(zhì)體(PHT-lipo)，高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)測定PHT-lipo在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)。Wistar大鼠隨機分為缺血再灌注組（I/R組）和假手術(shù)組（Sham組）。每組又分為三個亞組，于手術(shù)后即刻、第2、4d經(jīng)靜脈注射給予生理鹽水(saline)，空白脂質(zhì)體(Emp-lipo)或PHT-lipo。I/R模型采用左冠狀動脈結(jié)扎法，缺血45min然后持續(xù)再灌

7、注。Sham組為穿線不結(jié)扎。于術(shù)前、術(shù)后1、3、5、7、14、30d抽取大鼠尾靜脈血，運用流式細胞術(shù)檢測大鼠循環(huán)中單核細胞CD43+和CD43++兩個亞群各時間點的比例。術(shù)后第30d采用超聲心動圖和血流動力學(xué)評價心臟功能。隨后處死動物，留取心臟標(biāo)本進行病理染色。Masson染色檢測心肌梗死面積、膨展指數(shù)、膠原容積分數(shù)。麥胚凝集素(wheatgermagglutinin，WGA)檢測心肌橫斷面積。IsolectinB4染色檢測毛細血管密度

8、。
　　 結(jié)果:細胞實驗:1）RAW264.7中有表達的VGSCsα亞基有:NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7、NaV1.9和NaVX。2）應(yīng)用PHT之后，能使未誘導(dǎo)RAW264.7的M1型標(biāo)志物CCL5、TNF-α及NOS2表達明顯降低，使經(jīng)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)RAW264.7的M1型標(biāo)志物IL-1β、CCL2、CCL5及TNF-α表達降低。

9、TTX能降低未誘導(dǎo)RAW264.7的M1型標(biāo)志物IL-1β和CCL5表達，降低經(jīng)LPS誘導(dǎo)RAW264.7的M1型標(biāo)志物CCL2、CCL5及TNF-α表達。應(yīng)用藜蘆定之后，能使經(jīng)白介素-4（interleukin-4，IL-4）誘導(dǎo)RAW264.7的M2型標(biāo)志物Arg1表達降低。3）LPS激活NF-κB信號通路，VGSCs阻斷劑能抑制其激活，激動劑則能促進IL-4誘導(dǎo)后的活化。4）成功建立穩(wěn)定干擾NaV1.9的細胞株，RT-PCR法鑒定

10、干擾效率約80％。下調(diào)NaV1.9的表達使RAW264.7的增殖活性、吞噬能力和遷移功能顯著降低，M1型標(biāo)志物CCL5、NOS2表達降低，M2型標(biāo)志物Arg1、mannose表達升高，NF-κB的表達也降低。5）大鼠腹腔巨噬細胞中有表達的VGSCs是:NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7、NaVX、Scn1b、Scn3b和Scn4b。PHT抑制LPS引起的M1型巨噬細胞標(biāo)志物TNF-α、CC

11、L5表達的升高，促進IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞標(biāo)志物Arg1、TGF-β1的表達。動物實驗:1）大鼠尾靜脈注射給藥后，大鼠體內(nèi)的PHT和PHT-lipo的血藥濃度-時間曲線均符合二室模型。PHT-lipo組的T1/2α（分布半衰期）及T1/2β（清除半衰期）均短于PHT組，AUC略低于PHT組。2）單核細胞亞群在大鼠心肌缺血再灌注模型中存在動態(tài)改變:與基線相比，I/R-Saline組CD43+細胞比例從術(shù)后第1d開始升高，在第3d達到

12、高峰，之后逐漸下降，在第7d基本恢復(fù)基線水平;Sham-Saline組CD43+細胞比例在術(shù)后第1d亦明顯升高，但在術(shù)后第3d已降至基線水平。與Sham-Saline組相比，I/R-Saline組術(shù)后第3dCD43+細胞比例顯著性升高，其余時間點則無顯著性差異。CD43++單核細胞呈現(xiàn)與CD43+細胞相反的變化趨勢。3）PHT-lipo能夠抑制心肌損傷早期外周血CD43+單核細胞比例的升高，縮小心肌梗死面積，促進梗死區(qū)毛細血管增生，降低