PP-1在成骨細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)NF-κB通路中對(duì)IKK磷酸化水平的影響.pdf

1、蛋白質(zhì)磷酸化或去磷酸化調(diào)節(jié)是力學(xué)信號(hào)從細(xì)胞外傳向細(xì)胞內(nèi)并導(dǎo)致特定生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制。成骨細(xì)胞作為維持骨組織應(yīng)力改建平衡的主體細(xì)胞，既是應(yīng)力刺激的效應(yīng)細(xì)胞，又是機(jī)械生化信號(hào)傳遞的傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力能夠激活成骨細(xì)胞NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而完成對(duì)成骨細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控。目前，有關(guān)蛋白質(zhì)激酶在NF-κB力學(xué)信號(hào)通路中對(duì)IKK復(fù)合體的磷酸化作用的已經(jīng)得到一定程度的闡述，但與此相比，有關(guān)蛋白質(zhì)磷酸酶在細(xì)胞NF-κB力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

2、中，對(duì)IKK復(fù)合體去磷酸化調(diào)控機(jī)制并不清楚。
　　目的:
　　本研究通過構(gòu)建成骨細(xì)胞牽張應(yīng)力模型，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立穩(wěn)定高表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸酶-1（proteinphasphatase-1,PP-1）的MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞系,觀察過表達(dá)的PP-1在小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)NF-κB通路中對(duì)IKK磷酸化水平的影響。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：首先根據(jù)GenBank中已知的小鼠PP-1基因序列（

3、NM_031868），設(shè)計(jì)并合成引物，采用RT-PCR技術(shù)從MC3T3-E1細(xì)胞中擴(kuò)增蛋白質(zhì)磷酸酶-1（PP-1）基因,并將獲得的基因定向插入pCI-neo真核表達(dá)載體中，利用PCR、雙酶切以及測(cè)序鑒定。
　　在轉(zhuǎn)染前24h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)成70％匯合時(shí)，用脂質(zhì)體將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1細(xì)胞，，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后48h，向培養(yǎng)基中加入G418加壓有限稀釋篩選以建立穩(wěn)定高表達(dá)PP-1的M

4、C3T3-E1成骨樣細(xì)胞系，采用Westernblot法檢測(cè)PP-1的蛋白表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)二：通過多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)，對(duì)穩(wěn)定高表達(dá)PP-1蛋白的MC3T3-E1小鼠成骨樣細(xì)胞株施以8％形變率的周期性牽張力，作用5、15、30和60分鐘后，分別將細(xì)胞裂解，利用Westernblot分析，以轉(zhuǎn)染pCI-neo空載體組為對(duì)照，分別用抗pIKKα-Ser180及pIKKβ-Ser181的特異化磷酸化抗體檢測(cè)IKK磷酸化水平。<

5、br>　　結(jié)果：
　　一、將獲得的重組載體質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示，陽(yáng)性克隆擴(kuò)增出特異性目的基因大小的條帶；將提取的質(zhì)粒雙酶切，電泳結(jié)果表明，可切出符合載體大小的條帶及符合插入片段大小的特異條帶，另外，經(jīng)寶生物工程有限公司測(cè)序鑒定與目的序列完全一致，表明表達(dá)載體pCI-neo-PP-1構(gòu)建正確。
　　Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，目的蛋白表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞對(duì)

6、照組，PP-1蛋白能在轉(zhuǎn)染pCI-neo-PP-1的MC3T3-E1細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)。
　　二、運(yùn)用多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞株施以8％形變率的周期性牽張力后，發(fā)現(xiàn)無論哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與轉(zhuǎn)染空載體pCI-neo對(duì)照相比，過表達(dá)的PP-1均能明顯減少IKK的磷酸化水平。
　　結(jié)論：
　　本課題成功構(gòu)建了pCI-neo-PP-1真核表達(dá)載體，并進(jìn)一步建立了穩(wěn)定高表達(dá)PP-1蛋白的MC3T3-E1成骨