流體剪切應(yīng)力作用強(qiáng)度對內(nèi)皮細(xì)胞Fractalkine表達(dá)水平的影響.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是多種心腦血管疾病的基礎(chǔ)，血液流動產(chǎn)生的剪切應(yīng)力對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的影響在心血管系統(tǒng)疾病中起重要作用。在內(nèi)皮細(xì)胞，已發(fā)現(xiàn)多種受剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)的基因，包括趨化因子。Fractalkine（FKN）是已發(fā)現(xiàn)的趨化因子CX3C亞家族僅有成員，因兼有趨化和粘附的特殊性，與多種炎癥性疾病相關(guān)，并且在體研究發(fā)現(xiàn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)形成的AS斑塊處FKN表達(dá)增加，大量研究也表明FKN對于AS的形成和

2、發(fā)展具有重要意義。
　　方法：1.原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)：在新鮮（健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦分娩后立即取新生胎兒臍帶，長度15-20cm，取標(biāo)本時間≤4小時）臍靜脈內(nèi)注0.1％的Ⅱ型膠原酶消化獲得內(nèi)皮細(xì)胞，用M199生長液（含25%內(nèi)皮細(xì)胞上漲因子，ECGS）進(jìn)行培養(yǎng)，EA.HY926細(xì)胞株用M199生長液(無含ECGS)進(jìn)行培養(yǎng)。為更合理的選擇研究對象，比較兩組細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下形態(tài)、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化、細(xì)胞純度檢測CD3

3、1抗體表達(dá)及兩種細(xì)胞的增長曲線。
　　結(jié)果：⑴光學(xué)顯微鏡下形態(tài)觀察：原代HUVEC體外生長3～4d可鋪滿單層,細(xì)胞呈梭形、飽滿，漩渦狀排列生長,傳代后可見管腔樣結(jié)構(gòu)；EA.HY926細(xì)胞株胞質(zhì)多顆粒，2～3可鋪滿單層，可長成復(fù)層。⑵免疫組化結(jié)果分析：用Image-Pro Plus6.0軟件判斷Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色結(jié)果，原代HUVEC的平均光密度為4138.8±594.01，EA.HY926細(xì)胞株的平均光密度為2234.02±

4、78.78，T檢驗(yàn)得出P﹤O.O1，兩者平均光密度差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原代HUVEC的染色程度明顯比EA.HY926細(xì)胞株高。⑶電子顯微鏡下形態(tài)觀察：透射電鏡下，原代HUVEC里可發(fā)現(xiàn)較多的橫切與縱切的Webel-Palade小體，在EA.HY926細(xì)胞株較少。⑷細(xì)胞純度檢測：CD31抗體的表達(dá)率原代HUVEC細(xì)胞(85.36%)大于EA.HY926細(xì)胞株(70.82%)，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P﹤0.001，兩種細(xì)胞CD31表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

5、原代HUVEC高于EA.HY926細(xì)胞株。⑸原代細(xì)胞從48小時開始進(jìn)入生長期，96小時達(dá)到高峰后，細(xì)胞開始衰老，趨向凋亡。EA.HY926細(xì)胞株48h開始進(jìn)入生長期，96-120h達(dá)到高峰后，進(jìn)入穩(wěn)定生長，生長幅度較小。
　　結(jié)論：臍靜脈注Ⅱ型膠原酶消化法配合M199生長液（含25%ECGS）可迅速獲取大量內(nèi)皮細(xì)胞,其生物學(xué)特性明顯優(yōu)于EA.HY926細(xì)胞株,而細(xì)胞株由于細(xì)胞數(shù)量多，培養(yǎng)方法簡單，成活率高為特點(diǎn)，選用于較復(fù)雜，細(xì)胞

6、創(chuàng)傷較大的研究。2.為闡明內(nèi)皮細(xì)胞Fractalkine mRNA及蛋白表達(dá)與剪切應(yīng)力強(qiáng)度的關(guān)系，我們用不同強(qiáng)度的流體剪切應(yīng)力(2.62，4.58，6.54，10.47，15.71，19.64dyne/cm2)處理培養(yǎng)的EA.HY926人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株，然后采用熒光定量RT-PCR的方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞Fractalkine mRNA的表達(dá)量，采用雙抗體夾心ABC-ELISA技術(shù)檢測內(nèi)皮細(xì)胞Fractalkine蛋白質(zhì)的生成。
　　

7、結(jié)果：熒光定量FKN mRNA表達(dá)量，未處理組基礎(chǔ)表達(dá)量極少，為0.01±0.00，在剪切應(yīng)力4.58dyne/cm2時的表達(dá)量最高，為1.92±0.22，進(jìn)行單因素的方差分析，六組不同剪切應(yīng)力之間總P＜0.05，4.58dyne/cm2與其余組的相差比較均為P＜0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了證明剪切應(yīng)力強(qiáng)度與Fractalkine mRNA表達(dá)量之間的相關(guān)性，進(jìn)行兩組相關(guān)性分析，結(jié)果r=-0.35，p＞0.05，兩組數(shù)據(jù)沒有相關(guān)性。

8、ELISA法測定Fractalkine的蛋白表達(dá)量，未處理組基礎(chǔ)表達(dá)量極少，為0.016±0.00，剪切應(yīng)力4.58 dyne/cm2時的Fractalkine蛋白表達(dá)量最高，為0.15±0.04，進(jìn)行單因素方差分析均與其他剪切應(yīng)力下的蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了證明剪切應(yīng)力強(qiáng)度與Fractalkine蛋白表達(dá)量之間的相關(guān)性，進(jìn)行兩組相關(guān)性分析，結(jié)果r=-0.33，p＞0.05，兩組數(shù)據(jù)沒有相關(guān)性。
　　結(jié)論：此結(jié)果提示剪切應(yīng)