NF-κB-HIF-1α通路在IFN-γ誘導(dǎo)的腸上皮屏障損害中的機制研究.pdf

1、背景及目的:
　　腸上皮屏障(Intestinal Epithelial Barrier,IEB)是機體抵御外部環(huán)境最重要的防御屏障。它在消化吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)、水分及電解質(zhì)的同時,還能夠抵御腸道內(nèi)的大量細(xì)菌及其產(chǎn)物的入侵,維持機體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。這一防御系統(tǒng)主要有機械、免疫、生物、化學(xué)屏障四大部分組成,其中機械屏障是維持腸道屏障功能最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其結(jié)構(gòu)的破壞可導(dǎo)致腸道屏障功能障礙,引起細(xì)菌移位,造成腸源性感染,進(jìn)一步加重原發(fā)

2、疾病,誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS),甚至引起膿毒癥、多器官功能不全乃至多臟器功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)。干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)作為腸上皮間淋巴細(xì)胞( Intestinal Intraepithelial lymphocytes,iIEL)產(chǎn)生的重要的炎性介質(zhì)

3、,在腸上皮屏障的損害過程中發(fā)揮重要作用,然而其具體機制仍未闡明。
　　缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,在機體缺氧代償性反應(yīng)過程中能發(fā)揮重要作用。HIF-1對于缺血缺氧壞境中細(xì)胞能量代謝、離子代謝、兒茶酚胺代謝、血管收縮控制以及新生血管的生成、腫瘤細(xì)胞的凋亡等方面均具有重要的作用。近來有研究表明,在缺氧,缺血再灌注以及炎癥過程中HIF-

4、1α扮演一種腸粘膜屏障破壞者的角色。
　　目前已經(jīng)證明HIF-1α不僅能在低氧條件下活化,而且能在各種非低氧刺激下(包括各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子)活化。HIF-1α的這些非低氧刺激的一個共同機制在于都涉及到NF-κB依賴的HIF-1α水平的上調(diào)。最近的研究表明IFN-γ可通過多種途徑參與HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。另外,對IFN-γ信號通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ可以以非STAT-1依賴的方式激活NF-κB。由于IFN-γ和HIF-α都

5、在腸上皮屏障功能損害中發(fā)揮重要作用,但兩者在這一過程中的關(guān)系尚未明確。
　　因此,本課題擬應(yīng)用蛋白印跡、qRT-PCR、激光共聚焦、跨上皮電阻測定等技術(shù),探討在IFN-γ對腸上皮細(xì)胞中NF-κB、HIF-1α的活化影響,以及對維持腸上皮屏障功能起關(guān)鍵作用的緊密連接蛋白(Tight Junction,TJ)Claudin-1、Claudin-2、Occludin、ZO-1的表達(dá)及形態(tài)學(xué)的變化,并通過測定跨上皮電阻(Transepit

6、helial resistance,TER),闡明NF-κB/HIF-1α通路在IFN-γ誘導(dǎo)的腸上皮屏障損害中的作用及機制,進(jìn)而為腸上皮屏障的損傷及修復(fù)機制提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.建立腸上皮細(xì)胞系T84缺氧及IFN-γ干預(yù)模型,通過qRT-PCR及蛋白印跡技術(shù)(Western blot,WB)分別檢測缺氧條件及IFN-γ干預(yù)情況下腸上皮細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)變化及不同濃度和不同干預(yù)時間下IFN-γ對HIF-

7、1β的表達(dá)影響。
　　2.建立腸上皮細(xì)胞系IFN-γ干預(yù)模型,通過激光共聚焦技術(shù)檢測IFN-γ干預(yù)前后HIF-1α在腸上皮細(xì)胞T84細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的表達(dá)變化;并通過WB技術(shù)檢測IFN-γ對腸上皮細(xì)胞T84中NF-κB活化的影響,并利用NF-κB抑制劑吡咯二硫代氨基甲酸乙酯(pyrolidinedithiocarbamate,PDTC)明確NF-κB在IFN-γ誘導(dǎo)的HIF-1α中的作用。
　　3.通過Transwell小室細(xì)

8、胞培養(yǎng)建立體外單層腸上皮細(xì)胞系IFN-γ干預(yù)模型,結(jié)合NF-κB抑制劑PDTC及HIF-1α抑制劑YC-1,進(jìn)行跨上皮電阻(Transepithelial resistance,TER)測定技術(shù),明確NF-κB/HIF-1α通路在IFN-γ誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞TER變化中的作用。同時通過WB及激光共聚焦技術(shù),檢測IFN-γ對腸上皮細(xì)胞中TJ蛋白表達(dá)及形態(tài)學(xué)變化的影響,進(jìn)一步探討NF-κB/HIF-1α通路在IFN-γ誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷中的

9、作用及機制。
　　主要結(jié)果:
　　1.缺氧和IFN-γ處理均可引起T84腸上皮細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)增加,并且IFN-γ誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白增加是呈時間和濃度依賴性的,但HIF-1β蛋白的表達(dá)不隨 IFN-γ處理時間和濃度的變化而改變。
　　2.IFN-γ處理不僅可使T84腸上皮細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)增加,而且促進(jìn)HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮生物學(xué)功能。
　　3.IFN-γ處理能活化T84腸上皮細(xì)胞中的NF

10、-κB信號通路,NF-κB抑制劑PDTC則可抑制這一作用;同時,NF-κB抑制劑PDTC還能抑制IFN-γ誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白表達(dá)的增加。
　　4.IFN-γ處理可引起T84腸上皮細(xì)胞TER呈濃度和時間依賴性的降低,NF-κB抑制劑PDTC及HIF-1α抑制劑YC-1則可抑制IFN-γ誘導(dǎo)的TER降低。
　　5.IFN-γ處理可引起T84腸上皮細(xì)胞TJ蛋白Claudin-1和ZO-1的表達(dá)下降,Claudin-2表達(dá)增加,

11、并破壞其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu);NF-κB抑制劑PDTC及HIF-1α抑制劑YC-1均可減弱IFN-γ引起的TJ蛋白的變化及形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)論:
　　1.IFN-γ可引起T84腸上皮細(xì)胞中HIF-1α蛋白隨時間和濃度依賴性的增加,但不改變HIF-1β蛋白的表達(dá);同時IFN-γ處理還促進(jìn)HIF-1α蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增加,提示IFN-γ可以誘導(dǎo)HIF-1α蛋白活化,并入核發(fā)揮生物學(xué)功能。
　　2.IFN-γ處理能活化T84腸上皮

12、細(xì)胞中的NF-κB信號通路,NF-κB抑制劑PDTC則可抑制這一作用;同時,NF-κB抑制劑PDTC還能抑制IFN-γ誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白表達(dá)的增加,提示IFN-γ通過NF-κB信號通路參與了HIF-1α表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　3.IFN-γ可引起T84單層腸上皮細(xì)胞TER的降低,并使細(xì)胞TJ蛋白Claudin-1和ZO-1的表達(dá)下降,Claudin-2表達(dá)增加,并破壞其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu);而NF-κB抑制劑PDTC及HIF-1α抑制劑YC-