咖啡因通過腺苷受體介導(dǎo)的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)作用減輕小鼠EAE的病情.pdf

1、目的:
　　1.不同劑量咖啡因慢性干預(yù)作用對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎的影響及其分子免疫學(xué)機(jī)制。
　　2.不同階段咖啡因干預(yù)作用對小鼠EAE發(fā)病的影響。
　　3.咖啡因慢性干預(yù)作用對A2aR敲除小鼠EAE的影響，進(jìn)一步明確咖啡因慢性干預(yù)抑制EAE發(fā)病的作用機(jī)理。
　　方法與內(nèi)容:
　　SPF級C57BL/6小鼠（野生型及A2aR敲除基因型）小鼠:雌性，8-10周齡，體重16～20g。
　　實驗一:野

2、生型小鼠40只，隨機(jī)分為5組（每組8只）:①CFA陰性對照組;②EAE陽性對照組，③咖啡因飲水干預(yù)組(1mg·kg-1，10mg·kg-1，30mg·kg-1)。所有EAE模型組小鼠用MOG35-55混合CFA制成抗原乳劑皮內(nèi)注射，CFA陰性對照組以生理鹽水代替抗原肽制備“抗原乳劑”皮內(nèi)注射，0、48小時腹腔注射PT造模?？Х纫蚋深A(yù)自造模前10天起至EAE造模后第20天與對照組小鼠同期處死為止。自免疫當(dāng)日定為第0天，每日兩次觀察并記錄動

3、物行為學(xué)及體重的變化。采用量化評分法，比較不同咖啡因劑量干預(yù)下EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評分。實驗動物處死后取大腦及腰髓組織制作石蠟標(biāo)本，用H&E染色觀察評價中樞炎癥細(xì)胞浸潤和損害程度。同時用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerasechain reaction，RT-PCR)法測定小鼠大腦干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-17(interleukin-17，IL-1

4、7)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowth factorβ，TGF-β)及腺苷受體(adenosine receptor，AR) A1R、A2aRmRNA的表達(dá)。
　　實驗二:野生型小鼠42只，野生型小鼠42只，以EAE免疫當(dāng)天定為第0天，至免疫后第20天統(tǒng)一處死小鼠。在EAE發(fā)病不同階段分別給予30mg·kg-1的咖啡因干預(yù):①EAE陽性對照組（10只），無咖啡因干預(yù);②-10天～20天全程干預(yù)組(8只)，③-1

5、0天～0天干預(yù)組（8只），④0天～10天干預(yù)組（8只），⑤10天～20天干預(yù)組（8只），⑥CFA陰性對照組（6只）。EAE制模及觀察方法同實驗一。記錄EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評分。取大腦和腰髓組織制作石蠟標(biāo)本，用H&E染色觀察評價中樞炎癥細(xì)胞浸潤和損害程度，用免疫組織化學(xué)法檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞的離子鈣結(jié)合受體分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule1，Iba-1)表達(dá)。用RT-PC

6、R法測定小鼠IFN-γ、IL-17、TGF-β及A1R、A2aR mRNA的表達(dá)。
　　實驗三:野生型小鼠20只，A2aR敲除基因型小鼠20只，分組如下:①野生型CFA陰性對照組（4只），②野生型CFA咖啡因干預(yù)組（4只），③野生型EAE陽性對照組（6只），④野生型EAE咖啡因干預(yù)組（6只），⑤A2aR敲除CFA陰性對照組（4只），⑥A2aR敲除CFA咖啡因干預(yù)組（4只），⑦A2aR敲除EAE陽性對照組(6只)，⑧A2aR敲除EA

7、E咖啡因干預(yù)組（6只）。使用30mg·kg-1咖啡因干預(yù)自造模前10天起至EAE造模后第20天與對照組小鼠同期處死為止。EAE制模及觀察方法同實驗一。記錄EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評分。取大腦和腰髓組織制作石蠟標(biāo)本，用H&E染色觀察評價中樞炎癥細(xì)胞浸潤和損害程度，用Luxol Fast Blue(LFB)髓鞘染色檢測中樞髓鞘脫失情況，用免疫組織化學(xué)法定量分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)Iba-1表達(dá)。用RT-PCR法測定小鼠IFN-γ、IL-17

8、、TGF-β及A1R、A2aR mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.慢性咖啡因干預(yù)組EAE病情嚴(yán)重程度降低，最大神經(jīng)功能評分下降，中樞炎癥細(xì)胞浸潤程度下降，病理評分降低，促炎因子IL-17、IFN-γ表達(dá)降低，抑炎因子TGF-β表達(dá)上升。
　　2.經(jīng)咖啡因干預(yù)后，-10天～20天（全程）、10天～20天（發(fā)病期）干預(yù)組小鼠日均神經(jīng)功能評分低于EAE陽性對照組，與EAE組相比全程組最大神經(jīng)功能評分下降、10天～20天（

9、發(fā)病期）干預(yù)組發(fā)病潛伏期延長(P＜0.05)，10天～20天（發(fā)病期）干預(yù)組發(fā)病小鼠炎癥細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤相對較輕，咖啡因-10天～20天（全程）干預(yù)組炎癥細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤程度為最輕，多分布于脊膜周圍，病理評分-10天～20天（全程）干預(yù)組較EAE陽性對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。-10天～20天（全程）、10天～20天（發(fā)病期）干預(yù)組小鼠促炎因子IL-17低于EAE陽性對照組(P＜0.05)-10天～20天（全程）組小鼠I

10、FN-γ表達(dá)亦降低(P＜0.05)，-10天～20天（全程）、10天～20天（發(fā)病期）干預(yù)組小鼠抑炎因子TGF-β高于EAE陽性對照組(P＜0.05)，同時-10天產(chǎn)～20天（全程）、10天～20天（發(fā)病期）干預(yù)組小鼠A1R表達(dá)相對較高(P＜0.05)。
　　3.引入A2aR敲除基因型小鼠進(jìn)行EAE制模，經(jīng)咖啡因干預(yù)后發(fā)現(xiàn):無論野生小鼠還是敲除小鼠，咖啡因干預(yù)組均比對照組潛伏期延長(p＜0.05)，最大神經(jīng)功能學(xué)評分野生型咖啡因干

11、預(yù)組低于野生型EAE組，A2aR敲除型小鼠咖啡因干預(yù)亦低于敲除EAE組(p＜0.05)。咖啡因干預(yù)組小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤較EAE陽性對照組輕，髓鞘脫失狀況也較輕。促炎因子檢測顯示咖啡因干預(yù)組IL-17、IFN-γ低于EAE陽性對照組(p＜0.05)，A2aR敲除EAE咖啡因干預(yù)組抑炎因子TGF-β表達(dá)高于A2aR敲除EAE陽性對照組(p＜0.05)。AR檢測顯示咖啡因干預(yù)組A1R的表達(dá)均較相應(yīng)的EAE陽性對照組高(p＜0.05)。
　　

12、結(jié)論:
　　1.咖啡因慢性干預(yù)對EAE有一定的的保護(hù)作用，這一保護(hù)作用以30mg·kg-1的高劑量組最為顯著?？Х纫蚵愿深A(yù)可以上調(diào)A1R的表達(dá)含量，可能主要是通過上調(diào)A1R而發(fā)揮對EAE的保護(hù)作用。
　　2.-10天～20天（全程）干預(yù)組、10天～20天（發(fā)病期）干預(yù)組咖啡因減輕EAE的病情主要是通過上調(diào)A1R來實現(xiàn);10天～20天（發(fā)病期）干預(yù)組咖啡因干預(yù)的A1R上升，在-10天～0天（造模前期）干預(yù)組、0天～10天（潛

13、伏期）干預(yù)組未觀察到，提示咖啡因的上調(diào)A1R主要在EAE疾病發(fā)病期起作用（治療作用而非預(yù)防作用）。
　　3.咖啡因?qū)2aR敲除基因型小鼠EAE仍出現(xiàn)一定的保護(hù)作用，證明這一保護(hù)作用主要是通過A1R來實現(xiàn)的，而非A2aR。咖啡因作為非特異腺苷受體拮抗劑，在發(fā)病期慢性干預(yù)致A1R功能上調(diào)，A1R上調(diào)可以使促炎因子IL-17、IFN-γ釋放減少，同時抑炎因子TGF-β釋放增加，減少小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性，對炎癥細(xì)胞浸潤、繼發(fā)性脫髓鞘等起