人呼吸道腺病毒55型的基因組學(xué)與病原學(xué)特征研究.pdf

1、人腺病毒(Human Adenovirus，HAdV)是一類無包膜的雙鏈DNA病毒，分為A～G7個(gè)血清學(xué)組，包括56個(gè)血清型。HAdV經(jīng)呼吸道和消化道傳播，可引起人多種器官感染，對(duì)小兒和免疫缺陷者危害尤為嚴(yán)重。HAdV感染人體可引發(fā)急性腺病毒型肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎、乳糜瀉和急性間質(zhì)性腎炎等多種疾病。
　　其中HAdV-B組感染目前已成為急性呼吸系統(tǒng)疾病(Acute RespiratoryDisease，ARD)的重要因素。超

2、過5％的急性呼吸道傳染病為HAdV感染所致，特別是在急性下呼吸道感染兒童患者中HAdV感染陽性率最高可達(dá)37.3％。近年來，B2亞組中出現(xiàn)的新型HAdV-B55在成人特別是學(xué)校和軍隊(duì)特殊人群中引起日益頻繁的急性呼吸道傳染病流行。我國2009年首次報(bào)道了HAdV-B55疫情，導(dǎo)致247名師生及市民發(fā)病，1名學(xué)生死亡?？紤]到HAdV并未列入我國傳染病監(jiān)控病原，現(xiàn)有報(bào)道的HAdV疫情大多未鑒定型別，因此HAdV-B55在我國引起的成人急性呼吸

3、道傳染病流行可能遠(yuǎn)高于實(shí)際報(bào)道病例，其潛在威脅不容忽視。
　　由于抗原性上與HAdV-B11的聯(lián)系和差異，HAdV-B55早期被命名為HAdV-B11a。經(jīng)全基因組序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析，HAdV-B55實(shí)際為HAdV-B11和14的Hexon基因重組突變體。HAdV-B55作為一個(gè)新近受到關(guān)注的呼吸道感染類腺病毒，基因組及生物學(xué)特征均未明確。傳統(tǒng)的HAdV-B11主要導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)的感染，HAdV-B14和55則主要引起呼吸系統(tǒng)

4、感染。因此，明確HAdV-B55的基因組及生物學(xué)特征，闡明重組HAdV-B55與其親本病毒的聯(lián)系及差異，以及進(jìn)一步探討呼吸道HAdV重組與其致病性上的聯(lián)系，將可加深對(duì)呼吸道HAdV病原學(xué)的認(rèn)識(shí)，并為進(jìn)一步研究其重組與致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　本項(xiàng)研究從HAdV感染咽拭子樣本中，利用敏感細(xì)胞系分離獲得了HAdV-B55病毒株，完成了病原學(xué)鑒定，對(duì)其基因組特征及其進(jìn)化重組進(jìn)行了分析，并進(jìn)一步針對(duì)病毒重組，對(duì)HAdV-B55與親本病毒11

5、和14型在生物學(xué)特征上的差異進(jìn)行了系統(tǒng)比較，明確了HAdV-B55型重組后生物特征學(xué)上的改變，并初步探討了HAdV重組對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響及其與致病性之間的聯(lián)系。
　　一、新型HAdV-B55的分離與鑒定
　　我們自2011年山西HAdV-B55疫情中，從臨床咽拭子樣本中分離獲得了HAdV-B55毒株Y16/SX/2011(簡(jiǎn)稱Y16)。該毒株可感染呼吸道細(xì)胞系A(chǔ)549及HEp2，并引起明顯的細(xì)胞病變，A549細(xì)胞在感染2

6、4小時(shí)后即可觀察到細(xì)胞腫脹及圓縮等病變現(xiàn)象，隨著感染時(shí)間的延長，在感染48小時(shí)后細(xì)胞逐步出現(xiàn)了類似拉網(wǎng)樣空泡，而在感染5天后可導(dǎo)致細(xì)胞完全圓縮、脫落、融解。分離株可在A549細(xì)胞上有效增殖，病毒滴度最高可達(dá)2.45×108PFU/ml，并形成大小均一的噬斑形態(tài)。在電鏡下觀察HAdV-B55型病毒顆粒，HAdV-B55型具有與其他HAdV相似的電鏡形態(tài)，呈現(xiàn)典型的二十面體形態(tài)。在感染細(xì)胞后，細(xì)胞顆粒主要集中于細(xì)胞核內(nèi)，呈晶格狀排列。小鼠體

7、內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示Y16分離株無法感染小鼠和增殖，僅可引起非特異的病理性損傷。上述分離株病原學(xué)特征的初步鑒定，為進(jìn)一步開展HAdV-B55型基因組分析、致病機(jī)制及疫苗的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　二、HAdV-B55分離株基因組特征與進(jìn)化重組分析
　　為了進(jìn)一步分析Y16分離株的基因組及進(jìn)化特征，我們對(duì)其全長基因進(jìn)行了序列測(cè)定和基因組標(biāo)注，并進(jìn)一步以Genbank公布的HAdVB組序列為依據(jù)，進(jìn)行了進(jìn)化分析?；谌蚪M序列的進(jìn)化關(guān)

8、系顯示Y16分離株屬于HAdVB2亞組。序列同源性分析表明Y16株與我國2006年山西的QS-DLL分離株相似度高，僅有8個(gè)核苷酸上的差異;與HAdV-B11的同源性為97.6％，而與HAdV-B14的同源性為98.9％。進(jìn)一步對(duì)Y16主要表面衣殼蛋白Hexon、Fiber、Penton及E1A蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示分離株的Hexon與HAdV-B11型同源性較14型高為97.4％，與HAdV-B14型的同源性僅為92.5％

9、;但其他幾個(gè)蛋白如Fiber、Penton及E1A蛋白與HAdV-B14型的同源性均高于99％，顯著高于分離株與HAdV-B11型的同源性。對(duì)分離株的進(jìn)化關(guān)系分析同樣證實(shí)了上述結(jié)果，基于編碼蛋白Hexon、Fiber、Penton及E1A基因的進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，Y16的Hexon基因進(jìn)化關(guān)系與HAdV-B11相近，而Fiber、Penton及E1A基因及進(jìn)化關(guān)系均與HAdV-B14型屬同一進(jìn)行分支。進(jìn)一步對(duì)Y16毒株進(jìn)行重組分析，發(fā)現(xiàn)本次

10、分離到的Y16株為HAdV-B11型的Hexon蛋白和14型重組后的新型HAdV，其重組區(qū)為18695-19587位核苷酸區(qū)，其重組特征與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致。這些結(jié)果明確了我國HAdV-B55型的基因組及其變異情況，為HAdV流行分析與溯源，疫苗研制及制訂疾病防控策略等提供理論依據(jù)。
　　三、HAdV-B55與重組親本病毒HAdV11/14的病原學(xué)比較研究
　　為了明確HAdV重組對(duì)HAdV-B55生物學(xué)特征和致病性的影響，我

11、們系統(tǒng)比較了重組Y16分離株與其親本病毒HAdV-B11和14型細(xì)胞組織嗜性和體外生物學(xué)特征、不同溫度環(huán)境中在細(xì)胞內(nèi)的病毒增殖能力、蝕斑形態(tài)、生長曲線、熱穩(wěn)定性、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡、細(xì)胞吸附能力和干擾素的動(dòng)態(tài)變化等方面的差異。
　　研究結(jié)果顯示，HAdV-B55具有與HAdV-B11和14類似的一些生物學(xué)特征。三個(gè)型別的腺病毒均具有廣譜細(xì)胞嗜性，在不同組織來源的細(xì)胞系內(nèi)均可以實(shí)現(xiàn)有效的增殖;在A549細(xì)胞上均可形成典型的蝕斑形態(tài)。此

12、外，三個(gè)型別HAdV也可抑制細(xì)胞內(nèi)干擾素的產(chǎn)生。電鏡下未發(fā)現(xiàn)形態(tài)存在顯著差異。
　　進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HAdV-B55與HAdV-B11和14體外致病性存在一些顯著差異。HAdV-B55在A549、RD、HEp2、HepG2、HEK293和HeLa等六類細(xì)胞系內(nèi)致病變能力、細(xì)胞毒性以及致細(xì)胞凋亡能力均明顯弱于親本病毒11及14型;上述特征將有利于病毒在細(xì)胞中的持續(xù)增殖。在模擬上呼吸道環(huán)境中，HAdV-B55增殖與HAdV-B14接近，

13、但均快于HAdV-B11;在下呼吸道模擬環(huán)境中，HAdV-B55的增殖顯著快于HAdV-B11和14，且在A549細(xì)胞上的蝕斑形態(tài)顯著大于親本病毒HAdV-B11和14型。在熱穩(wěn)定性比較分析中，我們發(fā)現(xiàn)HAdV-B55型在37℃時(shí)的熱穩(wěn)定性明顯弱于親本病毒11和14型的穩(wěn)定性。上述結(jié)果提示基因重組與氨基酸突變?cè)贖AdV-B55型致病機(jī)制中的重要作用，HAdV衣殼蛋白Hexon的重組，可能與HAdV的復(fù)制能力及熱穩(wěn)定性存在著聯(lián)系。本部分的

14、研究結(jié)果為下一步揭示基因重組與HAdV毒力變異的關(guān)聯(lián)這一科學(xué)問題，為深入探索和闡明不同HAdV致病機(jī)制與流行特征奠定了基礎(chǔ)。
　　四、HAdV55快速檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)
　　為滿足HAdV-B55快速檢測(cè)篩查的需要，我們分別建立了環(huán)介導(dǎo)等溫快速檢測(cè)方法、實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法和區(qū)分HAdV-B11/14/55的多重PCR檢測(cè)方法等。這些方法具有較好的敏感性和特異性。其中HAdV-B55特異LAMP檢測(cè)方法，靈敏度與實(shí)時(shí)定量PC

15、R相當(dāng)，均可以檢測(cè)到0.008PFU/反應(yīng);同時(shí)，該方法還可無須提取核酸過程直接對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，極大方便了對(duì)HAdV感染的甄別。我們將上述建立的三種快速檢測(cè)方法應(yīng)用到臨床樣本的檢測(cè)中。實(shí)驗(yàn)證明三種方法均具有良好的特異性和靈敏度，可適應(yīng)在不同環(huán)境中HAdV-B55檢測(cè)及鑒定，可為臨床及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)/野外提供快速準(zhǔn)確的診斷信息。
　　本研究成功對(duì)人腺病毒55型Y16/SX/2011株進(jìn)行了分離與鑒定，并完成全基因組序列測(cè)定與分析，明確

16、了其與我國QS-DLL腺病毒55型分離株的8個(gè)核苷酸差異及其進(jìn)化特征，重組分析顯示分離株為HAdV-B11和14型的重組產(chǎn)物。進(jìn)一步的病原學(xué)比較研究顯示，HAdV-B55分離株在細(xì)胞嗜性，呼吸道細(xì)胞系上的增殖能力均強(qiáng)于親本病毒11和14型，而細(xì)胞毒性及致細(xì)胞凋亡能力則弱于親本株。本研究對(duì)HAdV-B55基因組特征與生物學(xué)特征的闡明，以及與其重組親本的病原學(xué)比較，為深入研究腺病毒進(jìn)化重組機(jī)制及其對(duì)病毒致病性的影響奠定了基礎(chǔ)，并為腺病毒的防