鉛在大腦內(nèi)的分布及其對樹突棘可塑性影響的初步研究.pdf

1、鉛是一種廣泛分布的環(huán)境重金屬毒物，具有顯著的神經(jīng)毒性，可以引起兒童學習記憶能力減弱和認知功能障礙等。近年研究發(fā)現(xiàn)，血鉛濃度作為鉛中毒的生物標志物并不能完全評價鉛的神經(jīng)毒性效應(yīng)，然而，這是否與鉛在大腦中的特殊分布以及蓄積有關(guān)，目前相關(guān)的報道甚少，因此，研究鉛在大腦中的分布對于闡明鉛神經(jīng)毒性作用機制具有重要的意義。
　　突觸可塑性是學習記憶形成的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)，包括功能可塑性和結(jié)構(gòu)可塑性，以往鉛損傷學習記憶功能的研究多集中于突觸的功能

2、可塑性，然而功能可塑性的改變并不能完全解釋鉛的神經(jīng)毒性機制。突觸的結(jié)構(gòu)可塑性是功能可塑性的基礎(chǔ)，因此，研究鉛暴露后突觸結(jié)構(gòu)可塑性的改變及其分子調(diào)控機制，對于闡明鉛損傷學習記憶功能的機制是一個新的突破口。
　　樹突棘可塑性是突觸結(jié)構(gòu)可塑性的重要組成部分，包括樹突棘密度和形態(tài)的變化。樹突棘作為興奮性突觸的突觸后膜，其數(shù)量和形態(tài)的變化對興奮性突觸傳遞具有顯著的影響，與學習記憶功能密切相關(guān)。Neuroligin1（NLGN1）是位于興奮性

3、突觸后膜上的突觸黏附分子，調(diào)控興奮性突觸的形成與形態(tài)。因此，研究鉛暴露是否通過影響 NLGN1的功能導致樹突棘可塑性損傷進而引起學習記憶功能障礙有可能為進一步闡明鉛損傷學習記憶功能的機制提供新的線索。綜上，本課題集中研究了鉛在大腦內(nèi)的分布及其對樹突棘可塑性影響，并初步探討了NLGN1在其中的作用。
　　目的：
　　本研究通過建立鉛暴露大鼠模型和原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元鉛暴露模型，綜合應(yīng)用形態(tài)學、分子生物學及功能學評價等技術(shù)手段

4、，觀察鉛在大腦內(nèi)的分布，研究鉛的蓄積對樹突棘可塑性的影響，并進一步探討NLGN1在其中的作用。研究結(jié)果將有助于進一步闡明鉛損傷學習記憶功能的分子機制，為探索潛在藥物治療靶點提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.建立模型
　　1)動物模型：孕期鉛暴露大鼠模型，分為對照組、鉛暴露組，通過飲水染毒，劑量為0、0.005％、0.01%和0.02%的醋酸鉛，在P10（postnatal day）結(jié)束鉛暴露，將P30雄性大鼠作為

5、研究對象。
　　2)細胞模型：原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元鉛暴露模型，鉛暴露濃度為0、0.1、1μmol/L的醋酸鉛，在DIV7（days in vitro）進行鉛暴露，持續(xù)5 d，于DIV12進行觀察。
　　2.利用原子吸收分光光度法檢測鉛在血液和大腦中的含量。
　　3.采用AMG（Autometallography）和XFM（X-ray flurescence microspectroscopy）檢測鉛在大腦中的分布。<

6、br>　　4.采用全細胞膜片鉗記錄檢測鉛對大鼠海馬LTP的影響。
　　5.通過尼氏染色觀察鉛暴露對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的影響；Golgi染色結(jié)合Imaris軟件觀察鉛暴露對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突發(fā)育和樹突棘的影響。
　　6.采用MTT法測定鉛對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活的影響，篩選合適的鉛暴露濃度。
　　7.利用免疫印跡法（Western Blot）觀察鉛暴露對大鼠海馬組織和原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元中NLGN1、P

7、SD-95和NR-2A蛋白表達的影響。
　　8.通過免疫熒光染色法觀察鉛暴露對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘的影響。
　　結(jié)果：
　　1.鉛在大鼠大腦內(nèi)的分布
　　1)檢測子代大鼠血鉛濃度發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，鉛暴露組大鼠在P0、3、7、10和21各時間點血鉛水平均顯著升高；而在P30，鉛暴露大鼠血鉛水平與對照組相比無顯著差異。
　　2) AMG結(jié)果顯示，與對照組相比，P10和P30鉛暴露組大鼠大腦中鉛的蓄積均

8、明顯增加，其中以海馬最為顯著。
　　3)原子吸收分光光度法結(jié)果顯示，與對照組相比，P10和P30鉛暴露大鼠海馬組織鉛含量顯著升高。
　　4) XFM實驗結(jié)果表明，與對照組相比，鉛暴露組大鼠大腦中鉛的含量顯著增多，且主要蓄積于海馬內(nèi)。
　　2.鉛暴露對大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘可塑性的影響
　　1)通過高頻刺激誘導大鼠海馬LTP發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，鉛暴露組EPSC的增加幅度顯著減小。
　　2)鉛暴露后海馬CA1區(qū)神

9、經(jīng)元密度、神經(jīng)元樹突分支數(shù)量無顯著變化，而神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低，其中thin、filopodium和mushroom形態(tài)的樹突棘數(shù)量均顯著減少。
　　3)免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，鉛暴露組原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低。
　　3.鉛暴露對NLGN1、PSD-95和NR-2A蛋白表達的影響
　　1) Western Blot結(jié)果表明，與對照組相比，鉛暴露組大鼠海馬組織中NLGN1、PSD-95和NR-

10、2A蛋白表達水平均顯著降低。
　　2) Western Blot結(jié)果顯示，與對照相比，鉛暴露組原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的NLGN1、PSD-95和NR-2A蛋白表達量均顯著減少。
　　結(jié)論：
　　1.鉛暴露后大鼠大腦中鉛含量顯著增加，且呈不均勻分布，其中海馬為鉛主要蓄積的部位。
　　2.鉛暴露導致大鼠海馬LTP受損，表明神經(jīng)元突觸功能可塑性損傷。
　　3.鉛暴露導致大鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度降低，且 th