骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及脂多糖對其增殖與分泌TNF-α的影響.pdf

1、目的：探討體外獲取高純度大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的方法，并觀察脂多糖(LPS)對其增殖及分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響。
　　 方法：應(yīng)用全骨髓貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力，并采用計(jì)數(shù)法測定其生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD44及CD45的表達(dá)。將BMSCs分為對照組及不同濃度LPS干預(yù)組(0μ

2、g/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)，采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察其增殖情況，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定TNF-α的分泌情況。
　　 結(jié)果：獲取的大鼠BMSCs形態(tài)呈均一成纖維細(xì)胞樣，并呈集落樣生長，細(xì)胞活力可達(dá)95％以上。細(xì)胞生長曲線顯示：在傳代后的第4～5天細(xì)胞開始明顯增殖，進(jìn)入指數(shù)增生期，6天后進(jìn)入平臺期。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，81.49％P3代細(xì)胞為G0/G

3、1期，符合干細(xì)胞的特征。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：CD44表達(dá)陽性，CD34、CD45表達(dá)陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的表型特征。MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組(0.190±0.037)相比，0.01μg/ml、0.1μg/ml及1μg/mlLPS干預(yù)組OD值均增高，其中0.01μg/mlLPS干預(yù)組(0.253±0.030)增高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而10μg/ml、100μg/mlLPS干預(yù)組OD值則較對照組

4、下降，其中10μg/mlLPS干預(yù)組(0.159±0.042)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組(30.373±0.633)相比，各濃度LPS干預(yù)組TNF-α濃度均有不同程度增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，0.01μg/mlLPS干預(yù)組TNF-α濃度最高，與1μg/ml、10μg/mlLPS干預(yù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與0.1μg/ml LPS干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：應(yīng)用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)出的大鼠BMSCs增殖能力強(qiáng)，具有MSCs的細(xì)胞表型特征，且此法簡單易行、適于推廣應(yīng)用，所培養(yǎng)的細(xì)胞可用于進(jìn)一步研究。LPS對BMSCs的增殖及分泌TNF-α均有影響，其與LPS濃度的關(guān)系表現(xiàn)為一定濃度的LPS作用可以促進(jìn)BMSCs的增殖及分泌TNF-α，但隨著LPS濃度的增大，BMSCs的增殖能力及分泌TNF-α均下降。為進(jìn)一步研究LPS對BMSCs的影響提供了科學(xué)的