Bacillus subtilis異丁醇合成菌株基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)的途徑改造.pdf

1、本研究借鑒合成生物學(xué)方法構(gòu)建了Bacillus subtilis異丁醇合成菌株;圍繞—構(gòu)建模型—預(yù)測靶點—指導(dǎo)實踐的系統(tǒng)代謝工程改造策略,建立了B.subtilis異丁醇合成菌株基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型指導(dǎo)的理性代謝途徑改造方法,提高了菌株的異丁醇合成能力。
　　為了獲得穩(wěn)定的B.subtilis異丁醇合成菌株,本工作構(gòu)建了由B.subtilis強啟動子P43、Lactococcus lactics kivd基因與Saccharom

2、yces cerevisiae adh2基因組成的異源 Ehrlich途徑,并將其整合至宿主染色體上。微氧條件下(20％裝液量,240 rpm,37℃,密封瓶口),重組菌株BSUL02-1的搖瓶產(chǎn)量達到0.93±0.12 g/L異丁醇。為了強化該菌株的產(chǎn)醇能力,引入由P43、B.subtilis alsS基因、Corynebacterial glutamicum ilvC和ilvD基因組成的異源α-酮異戊酸合成途徑,獲得菌株BSUL03

3、。在微氧條件下,以初始濃度20 g/L葡萄糖為底物,18 h補加葡萄糖至初始濃度,菌株的搖瓶產(chǎn)量達到2.62±0.19 g/L。
　　為了有效提高BSUL03的異丁醇合成能力,本研究建立了模型指導(dǎo)的菌株理性代謝改造方法。首次采用基元模式法分析了B.subtilis異丁醇合成菌株基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型,獲得239個合理的異丁醇合成模式。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)通量相關(guān)性與通量靈活度分析,預(yù)測出12個能夠顯著影響菌株異丁醇合成的靶基因。為了考

4、察模型預(yù)測的準確性,選擇ldh與pdhC敲除靶點,分析了模擬突變菌株的胞內(nèi)代謝通量分布。通過構(gòu)建雙缺失突變菌株BSUL05的實驗,驗證了在雙階段分批補料(好氧-微氧,40%裝液量,初始葡萄糖濃度10 g/L,低于1 g/L時補加1.6 mL500 g/L葡萄糖)條件下,BSUL05的發(fā)酵罐產(chǎn)量較BSUL03提高70%,約為5.5±0.3 g/L異丁醇;得率提高83%至0.31±0.02 C-mol異丁醇/C-mol葡萄糖,達到理論得率(

5、0.59 C-mol/C-mol)的53%,表明該模型能夠準確預(yù)測靶標基因并指導(dǎo)菌株改造。
　　在模型預(yù)測指導(dǎo)下,本工作對BSUL05進行了理性改造以提高菌株的異丁醇合成能力。通過敲除pgi基因、過表達B.subtiliszwf基因和Escherichia coli udhA基因,構(gòu)建了菌株BSUL08。該菌株NADPH濃度提高為親株BSUL05的2.6倍,且胞內(nèi)還原力得到良好平衡。在雙階段分批補料條件下,BSUL08的發(fā)酵罐產(chǎn)量