雷帕霉素原始菌株基因組尺度代謝模型的構(gòu)建及強(qiáng)化改造.pdf

1、雷帕霉素原始菌株基因組尺度代謝模型雷帕霉素原始菌株基因組尺度代謝模型的構(gòu)建及強(qiáng)化改造的構(gòu)建及強(qiáng)化改造EnhancementofrapamycinproductioninStreptomyceshygroscopicusbasedongenomescalemetabolicwkmodel學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：黨蘭慶指導(dǎo)教師：聞建平教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一六年十一月I摘要雷帕霉素（Rapamycin）是由吸水鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的一種大環(huán)內(nèi)

2、酯類化合物，具有免疫抑制、抗真菌和抗腫瘤活性。由于其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大貢獻(xiàn)尤其是在器官移植方面的抗排異作用，雷帕霉素正獲得越來越多的關(guān)注。然而，野生型吸水鏈霉菌的雷帕霉素生產(chǎn)能力是非常低的，限制了其產(chǎn)業(yè)化和工業(yè)化。本文擬通過構(gòu)建吸水鏈霉菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，在模型模擬預(yù)測指導(dǎo)下采用基因工程手段改造菌種，以提高雷帕霉素的生產(chǎn)能力。1、首先，收集KEGG代謝路徑數(shù)據(jù)庫中吸水鏈霉菌ATCC29253注釋基因組和生化信息，建立初始基因蛋白反應(yīng)

3、列表。添加Rapamycin生物合成的特征反應(yīng)和菌體合成反應(yīng)，經(jīng)過手動優(yōu)化后獲得了吸水鏈霉菌基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，模型包括1003個反應(yīng)，711個代謝物。然后，測定了菌株生長曲線、殘?zhí)乔€和雷帕霉素合成曲線，確定了菌株的比葡萄糖吸收速率和比雷帕霉素合成速率。以測定的參數(shù)作為模型的約束條件，以生物量為目標(biāo)函數(shù)，通過通量平衡分析算法（FBA）模擬出最大比生長速率為0.0535h1，與實驗測定的最大比生長速率0.0512h1相比，誤差在5%

4、的范圍內(nèi)，驗證模型具有較高的可信度。2、其次，利用FBA模擬計算獲得胞內(nèi)通量分布，在獲得胞內(nèi)通量分布的基礎(chǔ)上利用最小代謝調(diào)整（MOMA）算法預(yù)測了潛在提高雷帕霉素產(chǎn)量的靶基因。對預(yù)測的靶點進(jìn)行排序分析，篩選出了pfk（編碼6磷酸果糖激酶）敲除靶基因、初級代謝過表達(dá)靶基因dahP（編碼DAHP合酶）和次級代謝過表達(dá)靶基因rapK（編碼分支酸酶）。3、最后，在模型預(yù)測結(jié)果的指導(dǎo)下，分別在原始菌株ATCC29253中敲除pfk基因，過表達(dá)da

5、hP和rapK基因。與原始菌株相比敲除pfk基因雷帕霉素產(chǎn)量增加了30.8%，單過表達(dá)rapkdahP基因雷帕霉素的產(chǎn)量分別增加了36.2%和44.8%。為進(jìn)一步促進(jìn)雷帕霉素的合成，在pfk基因敲除菌株中共表達(dá)基因rapK和dahP構(gòu)建了重組菌株。重組菌株在28oC220rpm的培養(yǎng)條件下發(fā)酵120h后雷帕霉素的產(chǎn)量達(dá)到250.8mgl，相比相同培養(yǎng)條件下原始菌株的發(fā)酵產(chǎn)量增加了142.3%。模型預(yù)測和實驗結(jié)果表明這種方法在識別靶基因和