氨基酸代謝輪廓耦合RT-PCR分析誘變菌株高效發(fā)酵雷帕霉素.pdf

1、雷帕霉素（Rapamycin）是一種天然的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，具有各種各樣的生物活性，例如抗真菌、免疫抑制劑、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和抗衰老等。在臨床上被用于器官移植的抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療，相比環(huán)孢菌素而言，雷帕霉素表現(xiàn)出更強(qiáng)的臨床藥用價(jià)值和更低的毒副作用，因此雷帕霉素的研究備受學(xué)術(shù)界和各大制藥企業(yè)的青睞與關(guān)注。
　　1.根據(jù)以前文獻(xiàn)報(bào)道，莽草酸的添加能夠提高雷帕霉素的產(chǎn)量，本文從吸水鏈霉菌誘變菌株U2-3D9出發(fā)，進(jìn)行新一輪

2、紫外誘變篩選獲得一株雷帕霉素莽草酸耐受菌株U3-SD，其產(chǎn)量達(dá)到389.7mg/L，相比誘變菌株U2-3D9(273mg/L)，雷帕霉素產(chǎn)量提高了42.7％。
　　2.雖然通過(guò)紫外誘變獲得了一株雷帕霉素高產(chǎn)菌株，但是雷帕霉素高產(chǎn)機(jī)制仍然不清楚，而且通過(guò)比較吸水鏈霉菌誘變菌U3-SD與原始菌ATCC29253胞外發(fā)酵特性，結(jié)果仍然無(wú)法揭示雷帕霉素的高產(chǎn)機(jī)制。為了剖析雷帕霉素生產(chǎn)機(jī)理并用于強(qiáng)化其合成，利用氨基酸代謝輪廓分析比較原始菌與

3、誘變菌株U3-SD之間胞內(nèi)氨基酸庫(kù)變化來(lái)揭示限制雷帕霉素的合成因素。首先在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢測(cè)下86種代謝物被鑒定，然后采用主成分分析、層聚類(lèi)分析和偏最小二乘法分析發(fā)現(xiàn)原始菌和誘變菌之間存在代謝差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與雷帕霉素合成相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物有22種，最后在此基礎(chǔ)上通過(guò)代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝在雷帕霉素合成中具有重要的作用，包括賴(lài)氨酸、纈氨酸、色氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和鳥(niǎo)氨酸。
　　3.在氨基酸代謝輪廓分析指導(dǎo)下，

4、采用HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)上述7種氨基酸胞內(nèi)絕對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)誘變菌細(xì)胞內(nèi)氨基酸代謝供應(yīng)不足，即“氮饑餓現(xiàn)象”，且與原始菌之間濃度差異最顯著的是賴(lài)氨酸。為了驗(yàn)證賴(lài)氨酸代謝是雷帕霉素合成的關(guān)鍵代謝模塊，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和酶活檢測(cè)分析賴(lài)氨酸代謝途徑上的關(guān)鍵酶（二氫吡啶二羧酸合酶、丙酮酸羧化酶和賴(lài)氨酸環(huán)化脫氨酶），結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘變菌賴(lài)氨酸代謝途徑上關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄水平和酶活均提高了，表明這三個(gè)酶與雷帕霉素合成具有正相關(guān)性，在理性指導(dǎo)下通過(guò)添加不同濃