豬帶絳蟲乳酸脫氫酶A(Ts LDHA)和B(Ts LDHB)基因克隆表達(dá)、免疫學(xué)特性分析及亞細(xì)胞定位.pdf

1、目的:從豬帶絳蟲（Taenia solium）成蟲cDNA文庫中篩選出乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDH-A）和乳酸脫氫酶B(lactate dehydrogenaseB，LDH-B)的同源序列，分析和預(yù)測兩者編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，并對其進(jìn)行克隆表達(dá)、免疫學(xué)特性分析及亞細(xì)胞定位研究。
　　方法:通過生物信息學(xué)方法從豬帶絳蟲成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫中識別豬帶絳蟲乳酸脫氫酶A（TsLDH-A)和

2、乳酸脫氫酶B（TsLDH-B）基因及其編碼區(qū)，利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)、瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASy)和免疫表位數(shù)據(jù)庫分析資源（IEDB Analysis Recource）中有關(guān)的生物信息學(xué)分析工具，結(jié)合其它生物信息學(xué)分析軟件包，預(yù)測、分析兩基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。將兩基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸桿菌BL-21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后用以免疫SD大鼠

3、制備免疫血清，ELISA檢測抗體滴度。用蛋白印跡(Western Blotting)方法分析純化的重組蛋白的初步免疫學(xué)特性，免疫熒光組織定位方法檢測目的蛋白在成蟲的定位。以PEGFP-N1為載體構(gòu)建真核表達(dá)體系并轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，RT-PCR及WesternBlotting方法鑒定目的基因在所轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞的表達(dá)，GFP示蹤及細(xì)胞免疫熒光方法觀察目的蛋白在Hela細(xì)胞的定位。
　　結(jié)果:兩序列都是包含完整開放閱讀框的全長基因，

4、推導(dǎo)出的氨基酸序列與GenBank中其它物種LDH-A或LDH-B同源基因氨基酸序列的一致性均超過50％。兩者編碼的蛋白在氨基酸數(shù)目(331)、較穩(wěn)定的蛋白理化性質(zhì)、L-乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域、構(gòu)成LDH酶催化中心的關(guān)鍵氨基酸、包含LDH活性位點(diǎn)的B細(xì)胞線性表位、無亞細(xì)胞定位等方面是一致的，但兩者在翻譯后的修飾位點(diǎn)、3個(gè)跨膜區(qū)和其他線性表位方面既相似也有區(qū)別。PCR、雙酶切及DNA測序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ts LDH-A和

5、pET-28a(+)-Ts LDH-B構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌BL-21/DE3中獲得可溶性表達(dá)，經(jīng)親和層析獲得了高純度蛋白。重組蛋白可被其免疫的SD大鼠血清識別，具有免疫原性;同時(shí)重組蛋白也能被豬帶絳蟲病患者血清及感染豬帶絳蟲囊尾蚴的豬血清識別，具有較好的免疫反應(yīng)性。兩重組蛋白均能被牛帶絳蟲患者血清、亞洲帶絳蟲患者血清、華枝睪吸蟲患者血清及血吸蟲患者血清所識別。免疫熒光組織定位結(jié)果顯示Ts LDH-A和Ts

6、 LDH-B分布于豬帶絳蟲成蟲的表膜。成功構(gòu)建了目的基因的真核表達(dá)系統(tǒng)，GFP示蹤及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示GFP-Ts LDH-A和GFP-Ts LDH-B融合蛋白在轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞膜上表達(dá)和定位。
　　結(jié)論:豬帶絳蟲成蟲同時(shí)表達(dá)A、B兩種L-乳酸脫氫酶。Ts LDH-A和Ts LDH-B具有較好的抗原性，并與其他蠕蟲的感染血清存在著交叉反應(yīng)，不適宜做囊蟲病的診斷抗原。Ts LDH-A和Ts LDH-B具有跨膜區(qū)，定位于成蟲皮層，