miR-152和miR-200s在IL-6誘導(dǎo)的肝胰島素抵抗中的作用.pdf

1、第一部分、miR-152和miR-200s在IL-6誘導(dǎo)的肝胰島素抵抗中的作用
　　 目的：胰島素抵抗是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制之一。microRNA是一簇長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼的小分子RNA。它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后水平對(duì)下游靶基因進(jìn)行調(diào)控。microRNA廣泛表達(dá)于各種組織器官中，對(duì)組織器官的功能和發(fā)育具有重要的作用。microRNA參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。它們調(diào)控胰島素的合成、分泌、胰島素信號(hào)通路和糖脂代謝等過程。

2、目前，與肝胰島素抵抗相關(guān)的microRNA報(bào)道尚少。研究證明miR-152和miR-200s與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但miR-152和miR-200s是否在肝胰島素抵抗發(fā)生中起重要作用？目前尚不清楚。本研究通過建立IL-6誘導(dǎo)的胰島素抵抗的細(xì)胞和動(dòng)物模型，分析細(xì)胞或肝臟組織中miR-152和miR-200s的表達(dá)變化，探討miR-152和miR-200s在IL-6誘導(dǎo)的肝胰島素抵抗中的作用，明確miR-152和miR-200s調(diào)節(jié)P13K

3、/AKT信號(hào)通路的分子機(jī)制。
　　 方法：1．以12周齡db/db小鼠作為胰島素抵抗模型小鼠，收集小鼠肝臟組織，用microRNA芯片分析肝臟中microRNA表達(dá)譜變化，并用Real-timePCR進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果。2.10ng/mlIL-6處理小鼠肝細(xì)胞系NCTC1469和C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞24小時(shí)，建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型，檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)和miR-152和miR-200s表達(dá)水平；在C57BL/6J小

4、鼠背部皮下埋泵緩釋注射IL-61周，建立IL-6誘導(dǎo)的胰島素抵抗動(dòng)物模型，觀察肝臟中P13KJAKT信號(hào)通路和miR-152和miR-200s表達(dá)水平。3．合成miR-152和miR-200smimics和inhibitors，并轉(zhuǎn)染入NCTC1469細(xì)胞，用Real-timePCR測(cè)定細(xì)胞中miR-152和miR-200s的水平，并且檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路和糖原水平。4．用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-200s的下游靶基因；以Wes

5、temblot分析miR-200s對(duì)下游基因FOG2和PTEN表達(dá)的影響。5．利用siRNA干擾FOG2和PTEN的表達(dá)，檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路和糖原合成水平。
　　 結(jié)果：1．與對(duì)照組小鼠相比，12周齡db/db小鼠的體重、血糖、血脂和血清IL-6水平明顯升高。在db/db小鼠肝臟中PI3K/AKT信號(hào)通路受到抑制，肝組織糖原含量顯著降低。microRNA芯片結(jié)果顯示，有31個(gè)microRNA表達(dá)升高，88個(gè)microR

6、NA包括miR-152和miR-200s表達(dá)下降。進(jìn)一步用Real-timePCR驗(yàn)證芯片的分析結(jié)果，結(jié)果顯示，在db/db小鼠肝組織中miR-152和miR-200s水平顯著低于對(duì)照小鼠。2．db/db小鼠體內(nèi)是多因素集合體，無法確定究竟是何種因素導(dǎo)致miR-152和miR-200s表達(dá)的降低。因此，我們用10ng/mlIL-6處理小鼠肝細(xì)胞系NCTC1469和小鼠原代肝細(xì)胞，以確定IL-6與miR-152和miR-200s之間的關(guān)系

7、。結(jié)果顯示，在小鼠肝細(xì)胞系NCTC1469和小鼠原代肝細(xì)胞中，IL-6抑制PI3K/AKT信號(hào)通路和糖原合成，并降低miR-152和miR-200s的水平。皮下緩釋注射IL-61周后C57BL/6J小鼠肝臟中PI3K/AKT信號(hào)通路和糖原合成受到抑制，miR-152和miR-200s水平也顯著降低。3．為了確定miR-200s的下游靶基因，我們用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，在FOG2和PTEN3’-UTR上均有miR-200s的結(jié)合位

8、點(diǎn)。Westemblot結(jié)果顯示，miR-200s能夠調(diào)控FOG2和PTEN的蛋白水平。4．進(jìn)一步確定FOG2和PTEN對(duì)胰島素信號(hào)通路和糖原合成的影響。在NCTC1469細(xì)胞中，利用siRNA干擾FOG2和PTEN的表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制FOG2和PTEN的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)IL-6對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路和糖原合成的抑制作用。5．最后，為了明確miR-152對(duì)miR-200s的調(diào)控作用，我們?cè)贜CTC1469細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-152inh

9、ibitors，Real-time結(jié)果顯示，抑制miR-152導(dǎo)致miR-200s的水平下降。
　　 結(jié)論：1．IL-6能夠降低miR-152和miR-200s水平，抑制肝細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路和糖原合成。2．miR-152和miR-200s可以逆轉(zhuǎn)IL-6對(duì)肝細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路和糖原合成的抑制作用。3．miR-200s通過下調(diào)FOG2和PTEN的表達(dá)而調(diào)控肝細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路和糖原合成。4．miR-1

10、52調(diào)節(jié)miR-200s的表達(dá)。
　　 第二部分、三七總皂甙抑制apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展
　　 目的：動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病。內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷和炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化的早期標(biāo)志之一。三七總皂甙(Panaxnotogingsengsaponins，PNS)具有抗氧化的特性，能夠清除氧自由基，抑制粘附因子和細(xì)胞因子的表達(dá)。糖基化終產(chǎn)物受體(receptorfora

11、dvanccdglycationendproducts，RAGE)參與了動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊的形成。RAGE在維持慢性炎癥和引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷過程中具有重要作用。目前研究報(bào)道，PNS能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，但是其分子機(jī)制尚未闡明。本研究用PNS處理apoE-/-小鼠，明確PNS對(duì)斑塊大小和內(nèi)容物的影響，揭示PNS通過抑制NF-kB活性和RAGE表達(dá)，降低粘附因子表達(dá)及下游信號(hào)通路，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的分子機(jī)制。
　　

12、 方法：1．以高脂飼料喂養(yǎng)20只10周齡雄性apoE-/-小鼠8周，建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，同步給予PNS藥物干預(yù)，以觀察對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響。收集外周血檢測(cè)血糖、血脂水平。為了確定PNS的抗氧化作用，檢測(cè)血清中MDA、SOD和GSH水平并用DHE染色法測(cè)定斑塊內(nèi)ROS的生成。2．用Movat染色觀察頭臂干和主動(dòng)脈根部斑塊大小；免疫組化法分析斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、膠原成分和平滑肌細(xì)胞的含量。3．用Westemblot分析動(dòng)脈粥樣硬

13、化斑塊中CD68、Galectin-3、RAGE、p38MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化水平以及下游的黏附趨化因子MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：1．PNS對(duì)apoE-/-小鼠的血糖和血脂均無明顯的影響。PNS處理4周后，明顯降低apoE-/-小鼠血清中MDA水平，升高血清SOD和GSH水平，同時(shí)降低主動(dòng)脈根部ROS水平。結(jié)果表明PNS具有顯著的抗氧化作用。2．Movat染色結(jié)

14、果顯示，PNS可顯著降低頭臂干部位斑塊的大小，而對(duì)主動(dòng)脈根部斑塊的大小沒有明顯的影響。免疫組化的結(jié)果顯示，PNS處理后頭臂干部位斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量減少，但膠原成分和平滑肌細(xì)胞含量沒有明顯變化。表明PNS抑制apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。3．提取整條降主動(dòng)脈的蛋白，Westermblot分析結(jié)果顯示，PNS抑制NF-κB活性相關(guān)蛋白和RAGE的表達(dá)以及ERK1/2、p38MAPK、JNK的磷酸化水平，降低VCAM-1、ICAM-1

15、和MCP-1表達(dá)。
　　 結(jié)論：1．PNS可升高apoE-/-小鼠血清中SOD和GSH水平，有效地降低血清中MDA水平和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)ROS的水平。表明PNS具有抗氧化作用。2．PNS能抑制NF-κB的活性。3．PNS可下調(diào)RAGE的表達(dá)。4．PNS通過抑制NF-κB活性和RAGE及其相關(guān)信號(hào)通路如JNK、ERK和p38信號(hào)通路蛋白的表達(dá)或激活，以抑制ICAM-1、VCAM-1和MCP-1等粘附因子表達(dá)，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化