TRPM7對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種不明病因的慢性自身免疫性臨床綜合征,主要表現(xiàn)為慢性、全身性、侵蝕性外周關(guān)節(jié)滑膜組織。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是滑膜組織的主要細(xì)胞,并與RA發(fā)病過程有著密切關(guān)系。如何抑制FLS增殖或促進(jìn)凋亡是研究RA的熱點(diǎn)。
　　文獻(xiàn)報(bào)道,RA發(fā)病過程中伴隨著ERS的參與。當(dāng)細(xì)胞遭到毒性藥物、感染、缺氧等刺激時(shí),使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

2、功能紊亂,產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS),引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔未折疊蛋白增多和細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,激活Caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,但是ERS是否引起FLS凋亡還未見報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)ERS的發(fā)生伴隨著細(xì)胞膜離子通道的改變,RA中ERS發(fā)揮功能是否與細(xì)胞膜離子通道蛋白有關(guān),尚未見報(bào)道。
　　瞬時(shí)受體電位通道7(transient receptor potential melastain7

3、,TRPM7)是一種具有陽(yáng)離子通道和蛋白激酶雙重結(jié)構(gòu)的雙功能膜蛋白,可使自身或底物磷酸化,也被稱為“通道酶”。TRPM7廣泛存在于機(jī)體組織中,通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子濃度參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、凋亡等多種生理病理過程。但其在RA發(fā)病過程中的作用并未被闡明。
　　本研究選擇佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)模型,因AA病理特征與RA相似,所以 AA模型作為動(dòng)物研究對(duì)象,FLS作為細(xì)胞研究對(duì)象,觀察TRPM7對(duì)

4、ERS誘導(dǎo)FLS凋亡的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容概括如下:
　　1.ERS在模型 FLS中的表達(dá)
　　為了檢測(cè) ERS在大鼠 FLS中的表達(dá)變化,通過弗氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant,CFA)建立AA模型。RT-PCR和Western blot檢測(cè)模型FLS中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志性蛋白CHOP的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常組和模型組FLS中都有CHOP表達(dá),但是模型組CHOP的mRNA和蛋

5、白表達(dá)明顯高于正常組。提示,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎FLS中ERS明顯異常。
　　2.TRPM7在FLS中的表達(dá)
　　為了檢測(cè)AA滑膜和FLS中TRPM7的表達(dá),通過RT-PCR和Western blot檢測(cè)AA滑膜和FLS中TRPM7的基因與蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常組滑膜和FLS中存在TRPM7,且模型組TRPM7的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于正常組。提示,AA大鼠FLS中TRPM7高表達(dá)。
　　3.ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素刺

6、激FLS凋亡及其對(duì)TRPM7的影響
　　給予ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素刺激AA大鼠FLS,分別通過細(xì)胞核染色檢測(cè) FLS細(xì)胞核的影響;RT-PCR法檢測(cè) TRPM7、CHOP的mRNA水平;Western blot法檢測(cè)TRPM7、CHOP、Calpain和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥組能顯著提高 TRPM7 mRNA和蛋白的表達(dá),明顯降低Caspase-3蛋白的表達(dá)水平,比正常組相比細(xì)胞凋亡增加。同時(shí)毒胡蘿卜素還

7、能增加CHOP和Calpain的蛋白表達(dá)。提示,增加ERS程度可以引起TRPM7表達(dá)增加。
　　4.抑制TRPM7對(duì)FLS凋亡和ERS的影響
　　采用非特異性阻斷劑Gd3+或2-APB阻斷AA大鼠FLS中TRPM7的表達(dá),觀察對(duì)ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)影響,通過RT-PCR、Western blot檢測(cè)TRPM7、CHOP、Calpain和Caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Gd3+或2-APB與正常組相比,能夠不同程度地降低

8、FLS中TRPM7 mRNA和蛋白的表達(dá),減少Caspase-3的表達(dá)。進(jìn)一步通過Hoechs33342進(jìn)行細(xì)胞核染色發(fā)現(xiàn),Gd3+或2-APB能不同程度的引起細(xì)胞核體積增大或破碎,提示FLS出現(xiàn)凋亡。同時(shí),Gd3+或2-APB能夠增加FLS中CHOP、Calpain的的表達(dá),進(jìn)一步提示下調(diào)FLS中TRPM7的表達(dá)可增加ERS程度。
　　利用Lipofectamine TM2000將特異性的TRPM7-siRNA轉(zhuǎn)染到RA FLS

9、中,下調(diào)TRPM7在FLS中的表達(dá)。分別通過細(xì)胞核染色檢測(cè)FLS細(xì)胞核的影響;RT-PCR法檢測(cè)TRPM7、CHOP mRNA的表達(dá);Western blot法檢測(cè)TRPM7、CHOP、Calpain和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,TRPM7-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡明顯增加,同時(shí)ERS標(biāo)志性蛋白CHOP明顯增加,說明ERS程度明顯提高。提示,阻斷TRPM7表達(dá)引起細(xì)胞凋亡可能與增加ERS程度有關(guān)。
　

10、　5.抑制TRPM7表達(dá)對(duì)毒胡蘿卜素誘導(dǎo)RA FLS凋亡的影響
　　為了進(jìn)一步研究TRPM7與ERS關(guān)系,先給予ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素誘導(dǎo)AA大鼠FLS凋亡,同時(shí)采用Gd3+或2-APB阻斷TRPM7的表達(dá)。RT-PCR、Western blot檢測(cè)TRPM7、CHOP、Calpain和Caspase-3的表達(dá);細(xì)胞核染色檢測(cè)FLS細(xì)胞核的影響。結(jié)果顯示,阻斷TRPM7表達(dá)能很大程度促進(jìn)ERS誘導(dǎo)FLS凋亡。提示,抑制TRPM7表