絲裂霉素C對類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖凋亡的影響及機制.pdf

1、目的:
　　本文觀察絲裂霉素C能否抑制體外培養(yǎng)的類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖并誘導其凋亡，并初步探討誘導凋亡的機制。
　　方法:
　　1、取類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織進行原代細胞的分離及培養(yǎng)，并通過倒置相差顯微鏡觀察觀察滑膜成纖維細胞的形態(tài)。
　　2、分別采用不同濃度的MMC(0、10、25、50、100 mg/L)處理FLS不同時間(0、6、12、24、48 h)后用CCK-8比色法檢測MMC對FLS增殖

2、活性的影響。應用50 mg/L MMC處理FLS不同時間(0、6、12、24、48 h)后用流式細胞儀及原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(TUNEL)法檢測MMC對細胞凋亡的影響，采用流式細胞技術(shù)檢測50 mg/L MMC作用FLS不同時間(0、1、3、6、12、24 h)后對細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響，通過Western blot法檢測線粒體凋亡蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、絲裂霉素C對FLS增殖的影響:
　　CCK-8法結(jié)果顯

3、示絲裂霉素C可呈時間和劑量依賴性抑制RA FLS的增殖，其中當50 mg/L MMC作用FLS24 h細胞存活率約為50％。
　　2、絲裂霉素C可誘導FLS發(fā)生凋亡:
　　流式細胞儀AV/PI雙染法結(jié)果顯示經(jīng)50 mg/L MMC處理0、6、12、24、48 h后，隨著處理時間的延長細胞凋亡率逐漸增加，凋亡細胞計數(shù)顯示MMC處理FLS12 h以上細胞凋亡率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。此外，我們還采用TU

4、NEL法來檢測RAFLS的凋亡，F(xiàn)LS經(jīng)50 mg/L MMC作用不同時間后，TUNEL的陽性率隨著作用時間的延長而逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、絲裂霉素C對細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響:
　　經(jīng)50 mg/L MMC處理FLS不同時間(0、1、3、6、12、24 h)后，流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示與對照組相比，實驗組細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4、絲裂霉素C對R

5、AFLS線粒體功能以及線粒體凋亡相關(guān)蛋白的影響:
　　為研究MMC導致的RAFLS凋亡后是否與細胞線粒體功能障礙有關(guān)，我們采用JC-1免疫熒光染色法來檢測細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△ψm)的改變。經(jīng)MMC處理后，熒光結(jié)果顯示FLS線粒體膜電位降低。此外，Western blot結(jié)果顯示50mg/L MMC處理RA FLS可增加Bax蛋白的表達水平，降低Bcl-2蛋白的表達水

6、平，并促進Caspase-9、Caspase-3以及PARP的活化裂解(P＜0.05)，且呈時間依賴性。我們進一步檢測了從線粒體內(nèi)向細胞漿中釋放的細胞色素C的含量，結(jié)果顯示經(jīng)MMC作用后細胞漿中細胞色素C的含量明顯增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、絲裂霉素C可在體外抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的增殖，且呈時間和劑量依賴性。
　　2、絲裂霉素C可誘導類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細