針對(duì)缺血再灌注損傷發(fā)展新的治療策略探索性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、缺血再灌注損傷是指組織細(xì)胞遭受一定時(shí)間的缺血缺氧后恢復(fù)血流，組織損傷程度迅速增劇的情況。再灌注后大量鈣內(nèi)流，并生成大量氧自由基，是該類組織細(xì)胞損傷的主要發(fā)病機(jī)制。臨床上多種疾病如中風(fēng)、心肌梗死、不可逆性休克、急性臟器功能衰竭及器官移植等的發(fā)生、發(fā)展都與缺血再灌注有關(guān)。
　　第一部分新型雙功能試劑四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物用于心臟缺血再灌注損傷的探索性研究
　　目的：
　　建立心臟缺血再灌注模型，探索四氫-β-咔啉

2、-RGD類肽綴合物的自由基清除活性,抗血栓形成活性和較高的穩(wěn)定性。
　　方法：
　　使用培養(yǎng)基培養(yǎng)P12細(xì)胞，置入96孔培養(yǎng)板上，經(jīng)過(guò)24小時(shí)粘附階段后，更換培養(yǎng)基并分別添加濃度為12.5?M,25?M,50?M,100?M,200?M的化合物12a-c至各孔，分別添加濃度為2mM硝普納(SNP)溶液并置入溫箱2小時(shí)產(chǎn)生NO損傷，1mM H2O2并置入溫箱1小時(shí)誘發(fā)H2O2損傷，1mM H2O2和30uMFe(II)置于溫箱

3、1小時(shí)誘發(fā)?OH損傷，通過(guò)MTT比色測(cè)定來(lái)計(jì)算細(xì)胞存活數(shù)量，以此評(píng)估四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物自由基清除能力，研究結(jié)果以EC50(?M)表示，使用方差分析來(lái)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。取材大鼠胸主動(dòng)脈并迅速將其置于灌注液中，加入10-9mol/L去甲腎上腺素(NE)溶液,當(dāng)高張性收縮達(dá)到最大水平時(shí)，清洗掉NE固定血管帶30分鐘。更換溶液，再次添加最終濃度為10-9mol/L的NE。當(dāng)主動(dòng)脈帶的高張性

4、收縮數(shù)值再次達(dá)到頂峰時(shí)，分別加入15μl生理鹽水或15?l濃度為10-6mol/L化合物12c的水溶液。固定后加入15μl最終濃度為10-6mol/L的乙酰膽堿溶液，記錄這種測(cè)試化合物對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)血管舒張作用的抑制百分率作為結(jié)果，評(píng)估四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)血管舒張作用的抑制作用。對(duì)加入抗凝劑枸櫞酸鈉的正常兔血離心獲得的富含血小板的血漿進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，添加自體血漿至2×105/μL濃度，使用PAF或ADP誘發(fā)血小

5、板凝集，分別加入四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行量化分析，選擇血小板聚集曲線的頂峰高度為最大血小板聚集率(Am％)。評(píng)估四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物抗血小板聚集活性。大鼠麻醉后分離右頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸靜脈，將一個(gè)稱量好的6cm線置于一個(gè)聚乙烯管的中央，聚乙烯管充滿肝素鈉溶液，一端插入左側(cè)頸靜脈，從另一端將肝素鹽水或測(cè)試化合物鹽溶液進(jìn)行注射后，將該端插入右側(cè)頸動(dòng)脈。15分鐘后移開(kāi)線并稱量，記錄濕血栓的重量，晾干此線持續(xù)2周

6、時(shí)間并在此記錄干血栓的重量。測(cè)定四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物抗血栓活性。將10mg各種測(cè)試化合物分別溶于1ml磷酸鹽緩沖液(pH8)中，加入0.5毫克胰蛋白酶。使反應(yīng)混合物保持37℃，使用高效液相色譜法每小時(shí)檢測(cè)一次受試化合物濃度。流動(dòng)相為含有0.1% CF3COOH的25% CH3OH水溶液。測(cè)定四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物12a-c體外對(duì)胰蛋白酶的穩(wěn)定性。建立心肌缺血再灌注模型，麻醉雄性 Wistar大鼠經(jīng)外科手術(shù)操作后于左

7、冠狀動(dòng)脈處留置4-0絲線，假手術(shù)組經(jīng)外科手術(shù)操作后不留置絲線，在冠脈阻斷前15分鐘給予大鼠灌注載體（二甲亞砜-生理鹽水，1:103; v/v）或12c（10 mg/kg），冠狀動(dòng)脈阻斷30分鐘后恢復(fù)灌注120分鐘，隨機(jī)分為以下4組：（1）假手術(shù)+載體組；（2）假手術(shù)+12c組；（3）I/R+載體組；（4）I/R+12c組。檢測(cè)缺血心肌組織中丙二醛（MDA）含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，再次結(jié)扎絲線，通過(guò)導(dǎo)管向左心室腔內(nèi)注射1% Evans藍(lán)溶液來(lái)描

8、繪左心室高危缺血區(qū)域，取心臟橫切片置于1%氯化三苯基四唑（TTC）溶液中，心臟被分為非缺血區(qū)域（Evans藍(lán)染色）和缺血再灌注區(qū)域（Evans藍(lán)不染色），而后者又分為缺血但存活部分（TTC染色），和梗死區(qū)域（TTC不染色）。使用兩因素方差分析后，利用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行 Scheffé’s檢驗(yàn)，如果存在差異，使用t檢驗(yàn)對(duì)成對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如果P<0.05則被認(rèn)為具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　所有測(cè)試化合物的自由基清除能力(EC50

9、)在如下范圍內(nèi)：對(duì) NO為88-96?M，對(duì)H2O2為34-75?M，對(duì)?OH為86-95?M。四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物12a,12b和12c的EC50值與1a的結(jié)果非常相似，這說(shuō)明它們具有與1a相似的NO，H2O2和-OH清除能力。對(duì)乙酰膽堿誘發(fā)血管舒張的抑制百分率來(lái)表示，前體化合物1a表現(xiàn)出良好的抑制能力，結(jié)果為81.03±4.12%；而四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物(12a-c)則表現(xiàn)出了更高的抑制能力，分別為90.12

10、±1.63,95.77±2.93,和97.15±1.15%。乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張作用被四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物1a和12a-c顯著抑制。對(duì)于ADP-誘發(fā)的血小板聚集，使用12a–c濃度為10-6 mol/L血小板聚集率降低至28–30%(NS:55.80%±4.32%;1a:47.83%±3.58%，n=8，p<0.001)。在PAF-誘發(fā)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)中，可觀察到類似的結(jié)果。四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物很有可能對(duì)血小板

11、聚集有非常強(qiáng)的抑制作用。使用12a-c治療的血栓重量分別為4.85±0.93 mg,3.79±0.29 mg,和2.23±0.16mg(NS:9.28±1.32，p<0.01)。所以，在使用劑量為5μmol/kg的時(shí)候，12a-c的抗血栓形成活性要高于11a-c。在胰蛋白酶進(jìn)行水解作用后12a、12b和12c的耗竭時(shí)間分別為4小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)。再灌注開(kāi)始120分鐘后，MDA含量在假手術(shù)組和缺血再灌注及12c治療組中均較低，但是在缺血

12、再灌注無(wú)12c治療組中，MDA含量為4.90±0.87 nmol/mg組織，而12c可減少M(fèi)DA含量至2.91±0.63 nmol/mg組織。12c能夠減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和細(xì)胞損傷。完全阻斷心臟血流30分鐘后，發(fā)現(xiàn)整個(gè)心室均為高危區(qū)域，12c治療組較缺血再灌注損傷組心肌梗死面積的百分率明顯降低。
　　結(jié)論：
　　四氫-β-咔啉-RGD類肽綴合物具有抗血栓形成能力,自由基清除能力和較高的穩(wěn)定性，可能能夠減輕缺血再灌注造成的損傷

13、。
　　第二部分新穎的氮氧自由基-氨基酸綴合物用于肝臟缺血再灌注損傷的探索性研究
　　目的：
　　本研究試圖將抗氧化部分（氮氧自由基）與一系列氨基酸進(jìn)行鏈接，以期合成氮氧自由基-氨基酸綴合物，探索其是否能夠?qū)Ω闻K缺血再灌注損傷提供協(xié)同保護(hù)作用。
　　方法：
　　使用培養(yǎng)基培養(yǎng)P12細(xì)胞，置入96孔培養(yǎng)板上，經(jīng)過(guò)24小時(shí)粘附階段后，更換培養(yǎng)基并分別添加濃度為12.5?M,25?M,50?M,100?M,200

14、?M的測(cè)試化合物至各孔，分別添加濃度為2mM硝普納(SNP)溶液并置入溫箱2小時(shí)產(chǎn)生NO損傷，1mM H2O2并置入溫箱1小時(shí)誘發(fā)H2O2損傷，1mM H2O2和30uMFe(II)置于溫箱1小時(shí)誘發(fā)?OH損傷，通過(guò)MTT比色測(cè)定來(lái)計(jì)算細(xì)胞存活數(shù)量，以此評(píng)估氮氧自由基-氨基酸綴合物的自由基清除能力，研究結(jié)果以EC50(?M)表示，使用方差分析來(lái)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟缺血再灌注損傷模型，麻醉雄性

15、Wistar大鼠經(jīng)外科手術(shù)操作后用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動(dòng)脈，30min后去除血管夾，恢復(fù)缺血肝血流。雄性Wistar大鼠被隨機(jī)分為三組：（1）假手術(shù)組(n=4)；（2）缺血再灌注組：肝臟缺血30分鐘后恢復(fù)灌注2小時(shí)（n=8）；（3）缺血再灌注+藥物干預(yù)組：在恢復(fù)灌注前10分鐘及恢復(fù)灌注后1小時(shí)兩次給藥，均給予測(cè)試化合物(n=8)。（1）和(2）組的大鼠使用生理鹽水作為對(duì)照，進(jìn)行腹腔內(nèi)注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，立即取材血液

16、和肝臟標(biāo)本，于?70℃下冷凍。分別測(cè)定血清ALT、AST水平，測(cè)定組織勻漿及血漿丙二醛（MDA）水平。將肝臟標(biāo)本迅速冷凍，切片、并行HE染色。用兩因素方差分析后，利用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Scheffé’s檢驗(yàn)，如果存在差異，使用t檢驗(yàn)對(duì)成對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如果P<0.05則被認(rèn)為具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　氮氧自由基-氨基酸綴合物（NNR和NNK）針對(duì)不同自由基表現(xiàn)出與其親代化合物氮氧自由基（NN）相當(dāng)?shù)淖杂苫宄芰?，其差別無(wú)統(tǒng)

17、計(jì)學(xué)差異。在缺血再灌注組MDA水平(4.86±2.43nmol/mg)較假手術(shù)組MDA水平(1.75±0.26nmol/mg)顯著升高（P<0.05），L-精氨酸或NNR治療組均使得MDA水平較缺血再灌注損傷組下降。缺血再灌注組血清ALT水平為1530±750U/L，較假手術(shù)組（52±4 U/L）明顯升高，且具有顯著差異（P<0.001)。NNR+I/R組中ALT水平為173±50 U/L，明顯低于I/R組(P<0.05)，但高于假手術(shù)

18、組。缺血再灌注組血清AST水平為1894±875U/L，較假手術(shù)組（182±30U/L）明顯升高，且具有顯著差異（P<0.001)。NNR+I/R組中AST水平為510±138U/L，明顯低于I/R組(P<0.05)，但依然高于假手術(shù)組。雖然NNR治療組的ALT和AST水平均低于L-精氨酸治療組，但兩者之間均無(wú)顯著性差異。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果說(shuō)明雖然在 I/R+NNR治療組中可以看到充血、壞死和肝細(xì)胞變化，但是其較I/R組形態(tài)學(xué)有明顯的改善。

19、
　　結(jié)論：
　　氮氧自由基-氨基酸綴合物可以顯著減少肝臟缺血再灌注造成的損傷。
　　第三部分新型的氮氧自由基-甘氨酸綴合物用于腎臟缺血再灌注損傷的探索性研究
　　目的：
　　利用腎臟缺血再灌注損傷大鼠模型來(lái)評(píng)估這種新型氮氧自由基-氨基酸綴合物的生物學(xué)活性，探討氮氧自由基-氨基酸綴合物是否能夠?qū)δI臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。
　　方法：
　　使用培養(yǎng)基培養(yǎng)P12細(xì)胞，置入96孔培養(yǎng)板上，經(jīng)過(guò)2

20、4小時(shí)粘附階段后，更換培養(yǎng)基并分別添加濃度為12.5?M,25?M,50?M,100?M,200?M的測(cè)試化合物至各孔，分別添加濃度為2mM硝普納(SNP)溶液并置入溫箱2小時(shí)產(chǎn)生NO損傷，1mM H2O2并置入溫箱1小時(shí)誘發(fā)H2O2損傷，1mM H2O2和30uMFe(II)置于溫箱1小時(shí)誘發(fā)?OH損傷，通過(guò)MTT比色測(cè)定來(lái)計(jì)算細(xì)胞存活數(shù)量，以此評(píng)估氮氧自由基-甘氨酸綴合物自由基清除能力，研究結(jié)果以EC50(?M)表示，使用方差分析來(lái)

21、對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。取材大鼠胸主動(dòng)脈并迅速將其置于灌注液中，加入10-9mol/L去甲腎上腺素(NE)溶液，當(dāng)高張性收縮達(dá)到最大水平時(shí)，清洗掉NE固定血管帶30分鐘。更換溶液，再次添加最終濃度為10-9mol/L的NE。當(dāng)主動(dòng)脈帶的高張性收縮數(shù)值再次達(dá)到頂峰時(shí)，分別加入15?l生理鹽水或15?l測(cè)試化合物的水溶液。固定后加入15?l最終濃度為10-6mol/L的乙酰膽堿溶液，記錄這種測(cè)試化合物對(duì)乙

22、酰膽堿誘導(dǎo)血管舒張作用的抑制百分率作為結(jié)果，評(píng)估氮氧自由基-甘氨酸綴合物對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)血管舒張作用的抑制作用。建立腎臟缺血再灌注模型，麻醉雄性Wistar大鼠經(jīng)外科手術(shù)操作，使用動(dòng)脈夾夾閉腎動(dòng)脈60分鐘，開(kāi)放恢復(fù)血供3小時(shí)。大鼠被隨機(jī)分為3組：（1）對(duì)照組：（n=4）；（2）缺血再灌注組：腎臟缺血60分鐘后恢復(fù)灌注3小時(shí)（n=6）；（3）缺血再灌注+藥物干預(yù)組：在恢復(fù)灌注前10分鐘及恢復(fù)灌注后1小時(shí)兩次給藥，分別通過(guò)腹腔內(nèi)注射的方式給予

23、測(cè)試化合物。（1）和（2）組的大鼠使用生理鹽水作為對(duì)照，進(jìn)行腹腔內(nèi)注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，立即取材血液和腎臟標(biāo)本，于?70℃下冷凍。測(cè)定腎臟丙二醛（MDA）水平和谷胱甘肽（GSH）水平、腎臟MPO活性及血尿素氮的水平。將腎臟標(biāo)本切片、并行HE染色。用兩因素方差分析后，原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Scheffé’s檢驗(yàn)，如果存在差異，使用t檢驗(yàn)對(duì)成對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如果P<0.05則被認(rèn)為具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　氮氧自由基-甘氨酸綴合

24、物(GNN)顯示出與氮氧自由基(NN)相當(dāng)?shù)淖杂苫宄芰Α］^NN而言，并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張作用被氮氧自由基-甘氨酸綴合物抑制，較 NN而言，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在缺血再灌注組MDA水平較對(duì)照組MDA水平顯著升高（P<0.05），測(cè)試化合物治療組使得MDA水平較缺血再灌注損傷組下降。缺血再灌注組GSH水平較對(duì)照組降低，測(cè)試化合物治療組水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異。缺血再灌注組MPO活性較對(duì)照組明顯升高，測(cè)試化合物治療組使得MPO活

25、性較缺血再灌注損傷組下降。缺血再灌注組血尿素氮水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，測(cè)試化合物治療組使得MPO活性較缺血再灌注損傷組明顯下降。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果說(shuō)明缺血再灌注導(dǎo)致了腎小球內(nèi)和腎小管周圍的膠原增生，而缺血再灌注損傷+氮氧自由基-甘氨酸綴合物治療組的腎臟組織的損傷明顯減輕。
　　結(jié)論：
　　氮氧自由基-甘氨酸綴合物可顯著地降低組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的水平，明顯地保護(hù)腎臟功能和減少組織學(xué)改變。
　　第四部分新穎的T

26、EMPO-PEG-RGDs小肽綴合物用于急性下肢缺血性疾病探索性研究
　　目的：
　　通過(guò)觀察在 ADP-或 PAF-誘發(fā)的體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)和大鼠動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)中新型化合物 TEMPO-PRG-RGDs綴合物抗小板聚集和抗血栓活性的影響，及TEMPO-PEG-RGDs綴合物進(jìn)行大鼠主動(dòng)脈帶實(shí)驗(yàn)中對(duì)缺血再灌注組織中自由基清除能力的研究，探討TEMPO-PEG-RGDF（作為一種代表化合物）減輕缺血再灌注造成的局部和遠(yuǎn)程臟器

27、損傷的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　健康清潔級(jí)wister大鼠38只（雄性,月齡4月，體重250～300g）被隨機(jī)分為3組：（1）假手術(shù)組：大鼠經(jīng)受外科手術(shù)操作過(guò)程（如下所述），但未進(jìn)行缺血再灌注損傷處理（n=6）；（2）缺血再灌注組：大鼠經(jīng)受下述外科手術(shù)操作，下肢缺血3小時(shí)后恢復(fù)灌注4小時(shí)（n=8）；（3）缺血再灌注損傷+藥物干預(yù)組：在缺血發(fā)生前15分鐘及缺血發(fā)生后15分鐘兩次給藥，均給予TEMPO-PEG-RGDF綴合物(

28、20 mg/kg)，在再灌注發(fā)生前15分鐘和再灌注發(fā)生1小時(shí)后均再次分別腹腔注射 TEMPO-PEG-RGDF綴合物(20 mg/kg)。（n=8）（1）和（2）組的大鼠使用生理鹽水進(jìn)行腹腔內(nèi)注射作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)立即分離下肢肌肉及心肌組織，并自升主動(dòng)脈快速取血，組織標(biāo)本分為兩部分，其中一部分被用于進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化分析，依據(jù)Beuge和Aust方法來(lái)測(cè)定MDA水平評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；另一部分立即在-30℃使用冰凍切片機(jī)制作組織切片、HE

29、染色、通過(guò)測(cè)量組織濕/干重量比值（W/D ratio）來(lái)評(píng)價(jià)組織水腫程度以進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)研究。使用兩因素方差分析后，利用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行 Scheffé’s檢驗(yàn)，如果存在差異，使用t檢驗(yàn)對(duì)成對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有的值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，如果P<0.05則被認(rèn)為具有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　在ADP-誘發(fā)血小板聚集實(shí)驗(yàn)及PAF-誘發(fā)血小板聚集實(shí)驗(yàn)中，本研究TEMPO-PEG-RGDs綴合物表現(xiàn)出來(lái)抗血小板聚集的活性。尤其是在體外細(xì)

30、胞實(shí)驗(yàn)中TEMPO-PEG-RGDs(最終濃度為100nM;溫箱培養(yǎng)時(shí)間為120分鐘)，與血小板上存在的ADP或 PAF共存時(shí)，會(huì)顯著改變血小板的聚集。本研究利用之前提到的大鼠模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 TEMPO-RGDs and TEMPO-PEG-RGDs的抗血栓作用，血栓重量改變被作為評(píng)估指標(biāo)(表3)。TEMPO-RGDs治療組(TEMPO-RGDS，TEMPO-RGDV，TEMPO-RGDF)的血栓重量分別為25.9±2.6,25

31、.1±1.9，and22.3±2.2 mg(NS:40.1±2.2 mg)。值得關(guān)注的是TEMPO-PEG-RGD(S，V,F)的抗血栓活性，濕血栓重量分別為23.6±2.8,24.7±2.2，and20.7±2.5 mg，較同等劑量(5μmol/kg)阿司匹林治療組(27.6±2.2 mg)要高。本研究中TEMPO它本身是一種弱的乙酰膽堿誘發(fā)血管舒張的抑制劑。相反，乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張能夠顯著地被TEMPO-RGDs或TEMPO-P

32、EG-RGDs綴合物所抑制，且這種抑制作用是劑量依賴性的。同時(shí)TEMPO-PEG-RGDs對(duì)于乙酰膽堿誘發(fā)血管舒張的抑制作用要強(qiáng)于 TEMPO-RGDs，但是兩者間并無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。假手術(shù)組(Sham),缺血再灌注組(I/R),缺血再灌注損傷+藥物干預(yù)組組織水腫評(píng)估顯示：Sham(3.18±0.25)，(I/R)組（5.60±0.37）(I/R+TEMPO-PEF-RGDF)（3.45±0.21），可見(jiàn)缺血再灌注組組織水腫情況較對(duì)照

33、組明顯加重(P<0.05)，但通過(guò)使用TEMPO-PEF-RGDF小肽綴合物后，較缺血再灌注組組織水腫情況明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)。本研究也通過(guò)進(jìn)行丙二醛（MDA）過(guò)氧化物歧化酶（SOD）定量分析來(lái)評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激反應(yīng)，假手術(shù)組(Sham),缺血再灌注組(I/R),缺血再灌注損傷+藥物干預(yù)組(I/R+TEMPO-PEG-RGDF) SOD和MDA水平檢測(cè)是：假手術(shù)組SOD（5.38?1.45）與MDA（2.19?0.38）；缺血再灌注組(I

34、/R) SOD（3.74?1.52）與MDA（5.65?0.29）；藥物干預(yù)組(I/R+TEMPO-PEG-RGDF) SOD（5.09?0.83）和MDA（2.37?0.44）。可見(jiàn)SOD和MDA的活性表達(dá)在假手術(shù)組與缺血再灌注組之間存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在缺血再灌注組與藥物干預(yù)組同樣存在明顯差異(P<0.05)。因此，本研究認(rèn)為TEMPOL本身治療能夠逆轉(zhuǎn)MDA的升高水平至一個(gè)較低的程度。SOD抑制自由基和粘附分子的

35、表達(dá)，所以能夠?qū)∪馊毖俟嘧p傷產(chǎn)生保護(hù)作用。冰凍切片機(jī)制作組織切片、HE染色進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)研究示：假手術(shù)組大鼠骨骼肌橫切面切片顯示了正常的結(jié)構(gòu)（HE染色），可見(jiàn)典型的肌束外包的肌束膜，同等大小的肌纖維以鑲嵌模式排列。相反，缺血再灌注組切片可見(jiàn)肌肉水腫、中性粒細(xì)胞聚集和細(xì)胞死亡。改良三色染色可以顯示間質(zhì)水腫，肌原纖維溶解，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞水腫和壞死，及可見(jiàn)散發(fā)的破裂紅纖維，都說(shuō)明出現(xiàn)廣泛的細(xì)胞損傷。另外，I/R組大鼠骨骼肌組織切片的N

36、ADH(煙酰胺-腺嘌呤-二核苷酸)染色可發(fā)現(xiàn)氧化代謝酶的無(wú)序分布。特別是在 NADH染色中慢肌纖維染色較深，相反快肌纖維染色較淺因?yàn)樘墙徒饽芰?qiáng)且線粒體含量較低，TEMPO-PEG-RGDF干預(yù)還是緩解了大部分損傷。除了H/E染色中偶見(jiàn)的空泡化纖維外，大多數(shù)肌肉纖維擁有完整的清楚邊界，內(nèi)容物質(zhì)地均勻，形態(tài)均勻一致。同時(shí)絕大多數(shù)纖維中NADH反應(yīng)較弱，反應(yīng)了TEMPO-PEG-RGDF對(duì)于缺血再灌注損傷的治療作用確實(shí)保護(hù)了大多數(shù)的組織。<

37、br>　　結(jié)論：
　　本項(xiàng)研究使用新型化合物 TEMPO-PRG-RGDs綴合物進(jìn)行 ADP-或PAF-誘發(fā)的體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)和大鼠動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TEMPO-PEG-RGDs綴合物具有顯著的抗血小板聚集和抗血栓活性。同時(shí)，使用TEMPO-PEG-RGDs綴合物進(jìn)行大鼠主動(dòng)脈帶實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估其自由基清除能力。TEMPO-PEG-RGDF（作為一種代表化合物）同樣顯示了其具有減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕缺血再灌注造成的局部和

38、遠(yuǎn)程臟器損傷的潛力。本項(xiàng)研究推測(cè) TEMPO-PEG-RGDs可能刺激單核細(xì)胞，且其氮氧自由基能夠清除細(xì)胞內(nèi)超氧離子和羥基自由基，從而抑制組織因子的合成而起到抗血栓形成的作用。PEG化學(xué)修飾可延長(zhǎng)TEMPO-PEG-RGDs綴合物的半衰期及在血液循環(huán)中的持續(xù)時(shí)間，從而提高治療作用。我們預(yù)言，新穎的TEMPO-PEG-RGDs綴合物有可能發(fā)展成為治療缺血再灌注損傷的有效藥物。
　　第五部分新奇的小肽綴合物用于急性下肢缺血探索性研究<

39、br>　　目的:
　　通過(guò)將β-咔啉生物堿多肽與溶栓多肽進(jìn)行鏈接，以探求β-咔啉生物堿-小肽綴合物的抗氧化和溶栓雙重活性；同時(shí)建立下肢缺血再灌注損傷模型，探索小肽綴合物對(duì)缺血肢體的保護(hù)性作用及機(jī)制，從而為臨床治療骨骼肌缺血再灌注腎損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠(250-300 g;食水不限)被隨機(jī)分為3組：（1）假手術(shù)組（n=6）：大鼠經(jīng)受外科手術(shù)操作過(guò)程，但未進(jìn)行缺血再灌注損傷處理

40、；（2）缺血再灌注組（n=8）：大鼠經(jīng)受下述外科手術(shù)操作，下肢缺血3小時(shí)后恢復(fù)灌注4小時(shí)；（3）缺血再灌注損傷+藥物干預(yù)組（n=8）：在恢復(fù)灌注前15分鐘及恢復(fù)灌注后1小時(shí)兩次給藥，均給予β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)（20mg/Kg）。（1）和（2）組的大鼠使用生理鹽水作為對(duì)照，進(jìn)行腹腔內(nèi)注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處理大鼠，立即分離下肢肌肉及心肌組織，并自升主動(dòng)脈快速取血，組織標(biāo)本分為兩部分，其中一部分使用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物生物化學(xué)分析

41、法檢測(cè)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)血漿丙二醛（Malondialdehyde，MDA）活性，以定量評(píng)價(jià)缺血危險(xiǎn)區(qū)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，另一部分立即在-30℃使用冰凍切片機(jī)制作組織切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)研究。利用細(xì)胞活體使用PC12細(xì)胞測(cè)試β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a,b,c)及其前體2a,b,c在對(duì)抗NO,H2O2和?OH時(shí)的自由基清除能力，研究結(jié)果以EC50(?M)表示。通過(guò)大鼠活體研究評(píng)估β-咔啉生物堿-小肽綴合物(24a,b,c,25a,b,

42、c,26a,b,c)是否具有母體化合物類似的溶栓活性。最終使用兩因素方差分析后，利用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行 Scheffé’s檢驗(yàn)，如果存在差異，使用t檢驗(yàn)對(duì)成對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有的值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，如果P<0.05則被認(rèn)為具有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　β-咔啉生物堿-小肽綴合物溶栓活性評(píng)估結(jié)果顯示：所有檢測(cè)物的清除能力（EC50）分別為：對(duì)NO為77-110?M，對(duì)H2O2為38-66?M，對(duì)?OH為72-94?M。β-咔啉生

43、物堿-小肽綴合物在體外胰蛋白酶作用下的穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示：β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a，26b和26c)在體外胰蛋白酶作用下衰竭時(shí)間分別為4小時(shí)，3小時(shí)和3小時(shí)。β-咔啉生物堿-小肽綴合物對(duì)于脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)標(biāo)記物-丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平影響顯示：肌肉缺血再灌注損傷組 I/R的缺血骨骼肌 MDA含量（7.8?0.3）較對(duì)照組Sham（0.6?0.1）明顯升高(P<0.05)，同時(shí)使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26

44、a)進(jìn)行干預(yù)后即I/R+26a組MDA（2.8?0.2）水平明顯回落(P<0.05)。肌肉缺血再灌注損傷組I/R的缺血骨骼肌GSH含量（0.2?0.05）較對(duì)照組 Sham（1.3?0.2）明顯降低(P<0.05)，同時(shí)使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進(jìn)行干預(yù)后即I/R+26a組GSH（1.0?0.1）水平明顯升高(P<0.05)。心肌缺血再灌注損傷組 I/R的缺血骨骼肌 MDA含量（5.1?0.4）較對(duì)照組Sham（1.3?0

45、.1）明顯升高(P<0.05)，同時(shí)使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進(jìn)行干預(yù)后即 I/R+26a組 MDA（1.5?0.1）水平明顯回落(P<0.05)。心肌缺血再灌注損傷組 I/R的缺血骨骼肌GSH含量（4.9?1.7）較對(duì)照組Sham（16.8?2.1）明顯降低(P<0.05)，同時(shí)使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進(jìn)行干預(yù)后即I/R+26a組GSH（14.7±3.2）水平明顯升高(P<0.05)。血液中缺血再灌注損傷

46、組 I/R的缺血骨骼肌MDA含量（5.8±0.3）較對(duì)照組Sham（2.5?0.1）明顯升高(P<0.05)，同時(shí)使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進(jìn)行干預(yù)后即 I/R+26a組MDA（2.8±0.2）水平明顯回落(P<0.05)。心肌缺血再灌注損傷組I/R的缺血骨骼肌GSH含量（4.1±0.3）較對(duì)照組Sham（4.1±0.3）明顯降低(P<0.05)，同時(shí)使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進(jìn)行干預(yù)后即I/R+26a組GS

47、H（9.1±0.2）水平明顯升高(P<0.05)。組織形態(tài)學(xué)研究：對(duì)骨骼肌冰凍橫截面切片行HE染色進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)分析，假手術(shù)組大鼠切片結(jié)果顯示肌纖維具有均勻的大小和形狀，成鑲嵌分布，多數(shù)彼此之間直接接觸，期間僅有一層薄薄的肌內(nèi)膜，總體來(lái)說(shuō)，是正常的組織學(xué)表現(xiàn)。相反，缺血3小時(shí)后再灌注導(dǎo)致重度的間質(zhì)水腫，及以腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的損傷。另一方面，使用β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)進(jìn)行干預(yù)后可預(yù)防間質(zhì)水腫，微血管的橫截面區(qū)域基本上

48、沒(méi)有改變。使用H/E染色的假手術(shù)組大鼠心肌切片顯示正常的結(jié)構(gòu)和緊密的心肌排列。缺血再灌注損傷組中再灌注引起的心肌損傷是明顯的，體現(xiàn)在血管周圍區(qū)域和肌纖維之間的組織水腫。水腫廣泛存在于心肌纖維和血管周圍。缺血再灌注+β-咔啉生物堿-小肽綴合物治療組中壞死并不明顯，且在間質(zhì)區(qū)和小血管內(nèi)僅可觀察到非常少量的炎癥細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　本項(xiàng)研究使用藥物干預(yù)缺血再灌注損傷以期獲得治療效果，一系列新合成的β-咔啉生物堿-小肽綴合物，在動(dòng)

49、物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，均表現(xiàn)出溶栓活性和自由基清除能力。本項(xiàng)研究選擇其中一種β-咔啉生物堿-小肽綴合物(26a)在下肢缺血再灌注損傷模型中進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有有效的自由基清除能力和溶栓活性,能夠?qū)勾笫笾w缺血再灌注引發(fā)的局部和遠(yuǎn)隔器官的損傷，而起到保護(hù)作用。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示β-咔啉生物堿-小肽綴合物可能成為一種新的抗缺血再灌注損傷的治療方法。
　　第六部分氮氧自由基綴合物聯(lián)合缺血后處理對(duì)下肢缺血再灌注損傷治療作用的實(shí)驗(yàn)研究

50、>　　目的：
　　本項(xiàng)研究通過(guò)對(duì)缺血組織后處理并聯(lián)合靜脈注射氮氧自由基綴合物的方式來(lái)共同應(yīng)對(duì)缺血再灌注損傷，評(píng)估甘氨酸-氮氧自由基綴合物聯(lián)合缺血后處理在急性下肢缺血再灌注損傷大鼠模型中的相關(guān)治療作用。
　　方法：
　　健康清潔級(jí)wister大鼠38只（雄性,月齡4月，體重250～3000g）隨機(jī)分五組：假手術(shù)組（n=6）：僅進(jìn)行常規(guī)麻醉，不阻斷后肢血流7h處理動(dòng)物；缺血再灌注組（n=8）：止血帶完全阻斷后肢血流3h，松

51、解阻斷4h后處理動(dòng)物；缺血再灌注+GNN治療組（n=8）:止血帶完全阻斷后肢血流3h，按30mg/kg劑量經(jīng)口喂食GNN藥丸，于恢復(fù)灌注前15分鐘以10mg/kg/min靜脈注射GNN，松解阻斷4h后處理動(dòng)物；缺血后處理合并靜脈注射生理鹽水組（n=8）:止血帶完全阻斷后肢血流3h，松解阻斷后，以60秒間隔反復(fù)阻斷后恢復(fù)灌注四個(gè)循環(huán)，以上述劑量于恢復(fù)灌注前15分鐘靜脈注射生理鹽水，4h后處理動(dòng)物；缺血后處理合并靜脈注射GNN組（n=8）:

52、止血帶完全阻斷后肢血流3h，松解阻斷后，以60秒間隔反復(fù)阻斷后恢復(fù)灌注四個(gè)循環(huán)，以上述劑量于恢復(fù)灌注前15分鐘靜脈注射GNN，4h后處理動(dòng)物。按各組要求時(shí)間點(diǎn)立即于升主主動(dòng)抽取血液標(biāo)本5ml，離心后取血清，裝入無(wú)菌凍存管，－70℃凍存?zhèn)溆?。并迅速取材各組織臟器，分為兩份，其中一份部分組織稱重以生理鹽水制備成10%勻漿，離心后取上清液裝入干凈凍存管，液氮凍存，進(jìn)行濕重/干重（W/D）比例的測(cè)定、組織勻漿及血漿丙二醛（Malondialde

53、hyde，MDA）測(cè)定、組織勻漿髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性測(cè)定、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），血尿素氮（BUN）及血肌酐（Cr）含量測(cè)定及血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平測(cè)定；另一部分組織用于干/濕比的測(cè)定。另一份冰凍切片機(jī)于-30℃溫度下行組織切片，采用HE染色，觀察組織形態(tài)的改變。最終數(shù)據(jù)使用雙因子方差分析后加用Scheffé’s檢驗(yàn)來(lái)對(duì)組間差異進(jìn)行比較，如果存在差異，使用

54、t檢驗(yàn)來(lái)比較成對(duì)數(shù)據(jù)。結(jié)果表達(dá)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。如果P<0.05則被認(rèn)為具有顯著差異。
　　結(jié)果：
　　血漿及肺組織勻漿MDA水平：缺血再灌注損傷組血漿（3.45±0.44nmol/ml）及肺組織（84.5±3.7nmol/g tissue）中MDA水平均較假手術(shù)組（血漿:1.67±0.13nmol/ml）；肺組織：41.8±3.2nmol/g tissue））明顯升高。但是單純?nèi)毖筇幚斫M大鼠MDA水平較缺血再灌注損傷組大鼠

55、無(wú)明顯下降。單純GNN治療（血漿:2.28±0.38nmol/ml）；肺組織：60.3±3.5nmol/g tissue））與GNN聯(lián)合缺血后處理治療（血漿:1.89±0.20nmol/ml）；肺組織：52.7±4.9nmol/g tissue））均可明顯抑制MDA產(chǎn)生，這說(shuō)明其可減弱脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及細(xì)胞損傷。組織氧化應(yīng)激損傷的指標(biāo)——髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性結(jié)果：缺血再灌注組大鼠 MPO水平（19.3±1.9 U/g）較假手術(shù)組大鼠

56、（8.0±0.6 U/g）顯著升高。單純GNN治療組大鼠（10.4±1.2 U/g）及GNN合并缺血后處理治療組大鼠（9.3±1.3 U/g）較缺血再灌注損傷大鼠的肺 MPO活性明顯降低。血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）結(jié)果：缺血再灌注損傷組大鼠（130.6±5.7 pg/ml）較假手術(shù)組大鼠（51.2±6.9 pg/ml）的TNF-α水平顯著升高。單純GNN治療組（85.8±9.1 pg/ml）及GNN合并缺血后處理治療組（72.2±

57、9.5 pg/ml）均較缺血再灌注損傷組的炎性細(xì)胞因子水平均顯著下降，GNN合并缺血后處理叫單純GNN治療更加有效，但是這些組間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織水腫的程度可通過(guò)測(cè)量組織濕干比（W/D）來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果所示再灌注損傷后組織水腫明顯。缺血再灌注損傷組大鼠較假手術(shù)組大鼠血清AST及ALT水平均明顯升高，說(shuō)明導(dǎo)致了嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷。單純GNN治療組大鼠及GNN合并缺血后處理進(jìn)行干預(yù)均可有效降低ALT及AST的水平。缺血再灌注組較假手術(shù)組血B

58、UN水平明顯升高，單獨(dú)給予GNN干預(yù)及GNN合并缺血后處理治療均可顯著降低血BUN水平。而且急性下肢缺血再灌注損傷確實(shí)導(dǎo)致血Cr濃度升高，而單獨(dú)給予GNN干預(yù)及GNN合并缺血后處理治療同樣可顯著降低Cr水平。
　　結(jié)論：
　　在該項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn)，單純進(jìn)行缺血后處理（間隔為60秒的四組循環(huán)）干預(yù)并未能起到顯著的保護(hù)作用。但是當(dāng)缺血后處理與氮氧自由基綴合物GNN共同作用時(shí)，兩者共同作用的治療效果就相當(dāng)顯著了。這向我們提示缺血后