粘紅酵母遺傳表達系統(tǒng)的建立.pdf

1、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)是生產(chǎn)胡蘿卜素、油脂、輔酶Q10等很有潛力的工業(yè)菌種，有很高的生物量和甲羥戊酸通量，并可在很多便宜易得的培養(yǎng)基上生長。利用同源重組將外源基因整合到酵母染色體上實現(xiàn)外源基因穩(wěn)定表達的技術(shù)已在釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和乳酸克魯維酵母等多種微生物中廣泛應(yīng)用。其中以rDNA為同源整合的靶順序構(gòu)建的載體，既克服了通常整合載體只有幾個拷貝的局限，同時又保留整合載體穩(wěn)定性好的特點。酵母轉(zhuǎn)化技術(shù)也日益成

2、熟。
　　 本文以遺傳和分子生物學(xué)信息匱乏的工業(yè)菌株As.2.102為研究對象，通過整合表達載體的構(gòu)建、表達系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，提供一種新的工業(yè)化生產(chǎn)一系列目的產(chǎn)物的菌株材料或相應(yīng)的微生物反應(yīng)器的技術(shù)平臺。
　　 比較粘紅酵母菌與不同酵母菌株的主要生理生化特性和發(fā)酵特征，以及研究在形態(tài)學(xué)、生長和抗生素敏感性的特征。
　　 以質(zhì)粒pPICZαA作為骨架，以質(zhì)粒pGAPZαA的組成型3'磷酸甘油醛脫氫酶啟動子gap

3、為啟動元件，博來霉素基因(shble)為抗性篩選標(biāo)記，綠色熒光蛋白酶基因(GFP)為報告基因，以從粘紅酵母基因組擴增得到的兩段621bp的26SrDNA和555bp的5.8SrDNA-ITS序列片段為同源整合位點，構(gòu)建了粘紅酵母整合性表達載體pGAPZ/rD/GFP。
　　 通過改良的PEG介導(dǎo)的醋酸鋰感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法和優(yōu)化粘紅酵母菌原生質(zhì)體制備、再生方法，建立適于As2.102菌株的轉(zhuǎn)化方法，獲穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效率。說明載體pGAP

4、Z/rD/GFP能同源整合到染色體上；通過抗性篩選和熒光檢測，重組子能表達Zeocin抗性基因和綠色熒光蛋白基因，并且構(gòu)建載體在粘紅酵母基因工程菌中具有良好的穩(wěn)定性，傳六代保留率在95％以上。說明構(gòu)建載體的適用性，以及成功建立粘紅酵母的表達系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
　　 在本文中還嘗試?yán)肦ACE技術(shù)擴增和克隆相關(guān)的基因片段和以pMD18T為基礎(chǔ)的啟動子探針載體篩選有啟動活性的基因組部分酶切片段，建立這兩種策略來克隆粘紅酵母自身的啟動子