骨誘導(dǎo)性化合物OIC-A006的發(fā)現(xiàn)、評(píng)價(jià)及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的： 骨修復(fù)是長(zhǎng)期以來(lái)臨床骨科普遍存在、并急需解決的問(wèn)題。盡管包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bonemorphogeneticproteins，BMPs)等在內(nèi)的諸多生長(zhǎng)因子已經(jīng)被研究證明具備明顯的骨誘導(dǎo)性能，但是在實(shí)際臨床應(yīng)用中均存在諸多缺點(diǎn)及不足。正是基于以上研究成果，本研究通過(guò)自主創(chuàng)新、篩選并合成了一種胺素類小分子化合物，命名為OIC-A006(Osteogenicinduciblecompound-active006)

2、。本研究詳細(xì)探討了該化合物的誘導(dǎo)成骨作用、初步闡明了其產(chǎn)生誘導(dǎo)成骨的作用機(jī)制以及綜合評(píng)價(jià)了其骨修復(fù)性能。通過(guò)此項(xiàng)工作研究者希望該化合物能夠克服以往骨誘導(dǎo)因子在臨床應(yīng)用中的不足，并為該化合物的研發(fā)應(yīng)用和更廣范圍的篩選骨誘導(dǎo)化合物提供理論指導(dǎo)依據(jù)。 方法： 取1.5月齡的雄性C57BL/6小鼠，原代培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowstemcells，BMSCs)，在細(xì)胞貼壁后第1、3、5、7、9、11、13d應(yīng)用M

3、TT法檢測(cè)BMSCs的增殖活性；當(dāng)細(xì)胞融合至80％，分別以含0、3.1、6.25、12.5和25μM的該化合物條件培養(yǎng)液干預(yù)，在干預(yù)后第5、10、15、20、25d時(shí)，分別應(yīng)用RT-PCR、Realtime-PCR、組織化學(xué)及放免法等技術(shù)檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)、Ⅰ型前膠原(Pro-collagenⅠ)、Ⅱ型前膠原(Pro-collagenⅡ)、核心結(jié)合因子al(Cbfal)等成骨性標(biāo)志基因的變化趨勢(shì)

4、并確定其誘導(dǎo)成骨的最適濃度；取新生1天的C57BL/6小鼠的顱骨和跖骨作骨組織旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，應(yīng)用組織化學(xué)染色和四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記檢測(cè)其骨量和骨體積變化及新骨形成情況；分別將一定濃度的該化合物溶液注射至健康成年小鼠股后部肌袋內(nèi)，應(yīng)用組織化學(xué)等技術(shù)觀察其體內(nèi)的異位骨形成情況，以了解小分子化合物OIC-A006的骨誘導(dǎo)性能。 通過(guò)Western-blot等技術(shù)，檢測(cè)BMSCs的Smad4蛋白表達(dá)情況；利用RNAi技術(shù)，阻遏smad4轉(zhuǎn)錄，同時(shí)

5、檢測(cè)OPN在OIC-A006影響下表達(dá)情況；克隆含OPN啟動(dòng)子基因的cDNA片段，構(gòu)建OPN啟動(dòng)子/熒光酶素報(bào)告基因表達(dá)載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染載體至293T細(xì)胞，在含特定濃度OIC-A006的條件培養(yǎng)液干預(yù)下培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)熒光酶素活性來(lái)確定OPN的表達(dá)情況，以了解和驗(yàn)OIC-A006的骨誘導(dǎo)作用有可能是模擬BMPs的功效并通過(guò)BMPs/Smads通路而發(fā)揮的。 制備兔顱骨臨界性骨缺損模型，在缺損處分別植入含一定濃度的OIC-A006的煅

6、燒骨顆粒復(fù)合物或單純煅燒骨顆粒。分別于術(shù)后4周、8周：應(yīng)用X-線檢查骨修復(fù)進(jìn)展?fàn)顩r；應(yīng)用微CT(μCT)測(cè)量骨體積和骨小梁構(gòu)筑；應(yīng)用組織化學(xué)染色和四環(huán)素標(biāo)記技術(shù)觀測(cè)新骨形成情況。綜合比較分析OIC-A006的骨修復(fù)復(fù)合材料的骨修復(fù)性能。 結(jié)果： 與非用藥干預(yù)組相比，由OIC-A006體外干預(yù)培養(yǎng)的BMSCs，MTT法檢測(cè)后顯示OIC-A006對(duì)細(xì)胞增殖未有明顯影響(P＞0.05)。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)和Realtime-

7、PCR技術(shù)，在含OIC-A006的濃度為3.1μM、6.25μM、12.5μM、25μM的條件培養(yǎng)液干預(yù)BMSCs后，與空白對(duì)照組相比，ALPmRNA表達(dá)隨化合物濃度增高而增加，呈明顯的量效依賴性；而OPN和CbfalmRNA的表達(dá)則在化合物濃度為6.25μM時(shí)達(dá)到最高值。 在含6.25μM濃度的OIC-A006條件培養(yǎng)液干預(yù)下，BMSCs成骨標(biāo)志性基因表達(dá)量呈時(shí)間依賴性變化，即隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間(5、10、15、20、25天)延長(zhǎng)

8、，其成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)量增加。通過(guò)Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)，PIC-A006組中ALP、Cbfal、OPN和Pro-CollagenⅠ，ⅡmRNA表達(dá)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組。其中，ALP，Pro-collagenⅠ，Pro-collagenⅡ和OPN培養(yǎng)10，15，20，25天后進(jìn)行兩組mRNA表達(dá)量均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，而Cbfal則在所有5個(gè)時(shí)間點(diǎn)上兩組差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。同時(shí)，Pr

9、o-collagenⅡmRNA表達(dá)在培養(yǎng)的第10天左右達(dá)到高峰后逐漸下降，而Pro-collagenⅠ則持續(xù)增高。 在OIC-A006為6.25μM最適濃度培養(yǎng)下，BMSCs生長(zhǎng)至20天時(shí)，行VonKossa染色和茜素紅染色。OIC-A006組鈣化結(jié)節(jié)明顯直徑較大、數(shù)量較多。光鏡下計(jì)數(shù)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量，OIC-A006組與對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；行OPN免疫細(xì)胞化學(xué)染色，顯示OIC-A006組較對(duì)照組棕色顆粒明顯增多

10、，表達(dá)增強(qiáng)；行骨鈣素測(cè)定(放免法)，顯示OIC-A006組較對(duì)照組骨鈣素含量明顯增強(qiáng)，且有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。 新生小鼠顱蓋骨及跖骨經(jīng)組織培養(yǎng)后，行組織化學(xué)染色和四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記技術(shù)可以觀察到與對(duì)照組相比，OIC-A006組明顯骨組織增粗，成骨細(xì)胞活躍，新骨形成明顯。同時(shí)，對(duì)新骨形成面積與新骨形成寬度分析也證明兩組具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。將OIC-A006注射至小鼠股后部肌袋內(nèi)，1周后即可以通過(guò)組織化學(xué)染色

11、發(fā)現(xiàn)有明顯的軟骨和細(xì)胞外特異性異染物質(zhì)形成。 在OIC-A006誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)成骨表型的過(guò)程中，與BMPs/Smad細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的Smad4蛋白表達(dá)量明顯增加，這種聯(lián)系通過(guò)BMSCs在培養(yǎng)第5、10、15天行Westernblot檢測(cè)，當(dāng)OIC-A006干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，Smald4蛋白表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)則明顯增加而獲得的(p＜0.05)；當(dāng)應(yīng)用RNAi技術(shù)將BMSCssmad4基因的表達(dá)阻遏后，OIC-A00

12、6對(duì)細(xì)胞OPNmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用明顯受抑，但OIC-A006干預(yù)下OPNmRNA表達(dá)仍然優(yōu)于單純阻遏smad4后OPN的表達(dá)，且兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；同時(shí)，通過(guò)將OPN啟動(dòng)子/熒光酶素報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，在含OIC-A006條件培養(yǎng)液干預(yù)下，轉(zhuǎn)基因的293T細(xì)胞OPN啟動(dòng)子表達(dá)增加，且與對(duì)照組相比，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。 應(yīng)用OIC-A006與煅燒骨復(fù)合材料進(jìn)行顱骨缺損修復(fù)的試

13、驗(yàn)研究。應(yīng)用X-線技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示OIC-A006與煅燒骨組成的復(fù)合物組較單純煅燒骨組骨缺損區(qū)域骨量增加，骨修復(fù)區(qū)域增大，骨修復(fù)作用明顯增強(qiáng)。應(yīng)用微CT(μCT)測(cè)量顯示實(shí)驗(yàn)組新生板層骨組織較多，骨小梁較粗大，板層骨8周已經(jīng)形成一定的有序排列結(jié)構(gòu)。相對(duì)于對(duì)照組，骨形態(tài)塑性明顯。應(yīng)用四環(huán)素標(biāo)記技術(shù)顯示OIC-A006組呈現(xiàn)明顯寬大、清晰的金黃色熒光雙標(biāo)線，提示成骨活躍，表明新生骨組織較對(duì)照組明顯增多；而對(duì)照組雙標(biāo)線融合在一起，提示成骨明顯

14、不活躍。 結(jié)論： 合成性小分子化合物OIC-A006可誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨表型，在體內(nèi)外呈現(xiàn)明顯的骨誘導(dǎo)活性；OIC-A006透過(guò)細(xì)胞膜后，其骨誘導(dǎo)作用機(jī)制主要發(fā)生二個(gè)環(huán)節(jié)： 一是可激活BMP/Smads信號(hào)通路中的Smad4、呈現(xiàn)類似BMP的骨誘導(dǎo)特性； 二是可直接觸發(fā)成骨性標(biāo)志基因OPN啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄；以O(shè)IC-A006激動(dòng)因素，設(shè)計(jì)與構(gòu)建的骨修復(fù)材料初步表現(xiàn)良好的骨修復(fù)性能，并展現(xiàn)出防治骨