重組人腫瘤壞死因子α衍生物的制備及聚乙二醇修飾.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文重組人腫瘤壞死因子α衍生物的制備及聚乙二醇修飾姓名：畢研偉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：徐維明李健峰20080601中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩士研究生畢業(yè)論文摘要摘要腫瘤壞死因子一a(TNF一Ⅱ)是一種抗腫瘤細(xì)胞因子，對(duì)各種腫瘤細(xì)胞有直接細(xì)胞毒作用，可激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，引起腫瘤的缺血性壞死，其作為一種潛在的抗腫瘤藥物的開發(fā)前景引起國(guó)內(nèi)外的廣泛重視。目前，其在國(guó)內(nèi)外臨床上有廣泛的應(yīng)用，常用

2、于肝癌、宮頸癌的治療，雖然其抗腫瘤的功能得到了充分的肯定，但是在使用過程中仍具有毒副作用、穩(wěn)定性差、半衰期短等缺點(diǎn)。蛋白質(zhì)PEG修飾技術(shù)在過去的近15年中得到了快速發(fā)展，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白質(zhì)藥物經(jīng)PEG修飾后降低了免疫原性、提高了穩(wěn)定性、延長(zhǎng)了半衰期，并用于臨床治療各種疾病。本文擬通過對(duì)腫瘤壞死因子一Q衍生物的聚乙二醇修飾，獲得低毒性、低免疫原性、高穩(wěn)定性的腫瘤壞死因子一a。對(duì)天然TNF—Q結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究表明，適當(dāng)改變其結(jié)構(gòu)，

3、可提高其殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，降低其對(duì)組織器官的毒副作用。本研究應(yīng)用搭橋PCR技術(shù)，將腫瘤壞死因子一a基因的前4位氫基酸的編碼序列刪除，對(duì)hTNF—a的第8／9／10／29／3l／157位氨基酸的密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變，將突變后的cDNA插入到pBV220載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pBV220一tnfaD4。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5Q，篩選獲得了高效表達(dá)TNF—QD4突變體的工程菌，表達(dá)的重組蛋白約占菌體蛋白總量的45％左右，經(jīng)硫酸銨沉淀和陽(yáng)離子

4、交換層析純化得到純度達(dá)90％以上的重組目蛋白，比活性達(dá)到8x107。在TNF—a的PEG修飾試驗(yàn)中，應(yīng)用了三種不同分子量的單甲氧基聚乙二醇丁醛(fⅡPEG一丁醛分子量分別為5k、lOk、20k)對(duì)TNFQ衍生物TNF_QD4進(jìn)行修飾。通過試驗(yàn)確定了最佳修飾條件，即反應(yīng)pH6O，TNF_QD4與fnPEG一丁醛(5k)質(zhì)量比1：2；TNF—QD4與mPEG丁醛(10k)質(zhì)量比1：4；TNF_QD4與mPEG一丁醛(20k)質(zhì)量比l：8，反

5、應(yīng)時(shí)間16h為最佳反應(yīng)條件。修飾產(chǎn)物經(jīng)陽(yáng)離子交換層析純化得到了較純的InPEGTNF—QD4，純度達(dá)85％以上。隨后，對(duì)TNF—aD4聚乙二醇單一修飾產(chǎn)物的部分性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明TNF—QD4及對(duì)其的聚乙二醇修飾達(dá)到了預(yù)期研究目標(biāo)。mPEG—TNF—QD4(5k)的比活性達(dá)至086107、mPEG—TNF—dD4(10k)比活性達(dá)至038107、mPEG—TNF—QD4(20k)比活性達(dá)至075106。與TNF—aD4相比，mPE