RNAi調(diào)控雄性小鼠睪丸uPA表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分 siRNA 干擾TM4細(xì)胞uPA表達(dá)的研究目的：采用化學(xué)合成的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染小鼠睪丸支持細(xì)胞株TM4細(xì)胞，觀察uPA表達(dá)的變化，篩選uPA-siRNA的有效干擾序列，為后續(xù)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的受Tet 調(diào)控的uPA 干擾載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：在驗(yàn)證TM4細(xì)胞有內(nèi)源性u(píng)PA表達(dá)的基礎(chǔ)上，針對(duì)小鼠uPA mRNA 靶序列設(shè)計(jì)三段不同的siRNA 序列（si-uPA1，si-uPA2，si-uPA3），

2、通過熒光標(biāo)記的siRNA（Cy3-siRNA）確定有效轉(zhuǎn)染濃度后，在陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000 介導(dǎo)下分別將三段si-uPA 序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞，設(shè)立空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染）、試劑對(duì)照組（加入Lipofectamine2000）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性siRNA，siRNA-scramble）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）和Western-Blot 技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞uPA mRNA和uPA 蛋白的

3、表達(dá)情況，分析比較uPA表達(dá)的變化，確定si-uPA的有效干擾序列。針對(duì)該序列，設(shè)定不同濃度（30 nM、50 nM和100 nM）的siRNA 轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞，分別作用24 h、48 h和72 h后，qRT-PCR測定uPA mRNA 改變，觀察siRNA 對(duì)TM4細(xì)胞uPA表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：TM4細(xì)胞中有內(nèi)源性u(píng)PA表達(dá)。20 nM的Cy3-siRNA 轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞后僅見微弱的Cy3 紅色熒光，隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，

4、熒光濃度逐漸增強(qiáng)，表達(dá)紅色熒光的TM4細(xì)胞增多，以50 nM和100 nM 最為明顯，選定50 nM 作為siRNA的有效轉(zhuǎn)染濃度。三種si-uPA轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞后，uPA表達(dá)量均較空白對(duì)照組明顯下降（P＜0.05），以si-uPA1 作用最為明顯，而試劑對(duì)照組uPA mRNA表達(dá)無明顯改變。用si-uPA1 轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞進(jìn)行時(shí)效量效實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞uPA mRNA的表達(dá)均較對(duì)照組顯著降低，其中100 nM組

5、抑制效果最為明顯，抑制率達(dá)到70％，抑制效果強(qiáng)于30 nM組和50 nM組（P＜0.05）；隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，uPA mRNA表達(dá)持續(xù)降低，轉(zhuǎn)染72 h后，三組細(xì)胞uPA mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的53.9％、35.3％和27.7％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：本部分成功篩選出針對(duì)uPA mRNA 靶序列的有效干擾序列si-uPA1，轉(zhuǎn)染TM4細(xì)胞后，在24 h 即可抑制細(xì)胞uPA mRNA的表達(dá)，抑制效

6、應(yīng)持續(xù)至72 h；同一濃度的si-uPA1在不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的抑制效應(yīng)無顯著性差異；同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，抑制效應(yīng)隨轉(zhuǎn)染濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。
　　 第二部分慢病毒介導(dǎo)的可誘導(dǎo)RNAi 體系的建立目的：在第一部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的含有Tet 調(diào)控元件的uPA 干擾載體，進(jìn)行病毒包裝和滴度測定后，感染TM4細(xì)胞，利用抗性篩選獲得TM4 雙穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，為后續(xù)Dox 調(diào)控提供前提條件。
　　 方法：根據(jù)第一部分實(shí)

7、驗(yàn)獲得的uPA-siRNA的有效干擾序列si-uPA1，設(shè)計(jì)合成uPA-shRNA oligo，退火成雙鏈，插入入門載體pENTR/H1/TO中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲取入門克隆。利用Gateway 技術(shù)的LR 重組反應(yīng)，將入門克隆中的H1/TO-RNA 干擾序列轉(zhuǎn)入慢病毒表達(dá)載體pLenti4-BLOCK-iT-DEST中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證，構(gòu)建針對(duì)uPA的慢病毒干擾載體pLenti4-sh。將慢病毒表達(dá)載體pLenti

8、4-sh和含有四環(huán)素抑制子（tetracycline repressor，TetR）的慢病毒載體pLenti6/TR分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒，收集病毒原液，超速離心濃縮，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)測定病毒滴度。用不同濃度的抗生素以及帶EGFP的慢病毒原液（Lentil-EGFP）感染TM4細(xì)胞，選擇抗生素的最佳篩選濃度和病毒感染的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值。在此基礎(chǔ)上，將pLenti6/T

9、R 慢病毒液感染TM4細(xì)胞，用Blasticidin 篩選陽性細(xì)胞，qRT-PCR檢測TetR的表達(dá)，建立TetR 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株TM4-Lenti6/TR；將pLenti4-sh慢病毒液感染TM4-Lenti6/TR，用Blasticidin和Zeocin 共同篩選陽性細(xì)胞，qRT-PCR檢測TetR和抗性基因的表達(dá)，建立雙穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株TM4-Lenti6/TR&Lenti4-sh。
　　 結(jié)果：針對(duì)uPA 靶序列構(gòu)建的慢病毒干擾載

10、體為pLenti4-sh，經(jīng)測序驗(yàn)證，序列比對(duì)完全正確。慢病毒包裝后，qRT-PCR測定Lenti6/TR 病毒的物理滴度為9.8×109vp/ml，Lenti4-sh 病毒的物理滴度為1.72×1010vp/ml。不同濃度抗生素作用TM4細(xì)胞后，根據(jù)細(xì)胞生長狀況觀察，選擇Blasticidin 最佳篩選濃度為1 μg/ml，Zeocin的最佳篩選濃度為600 μg/ml。隨著感染TM4細(xì)胞的Lentil-EGFP MOI 值的增大，表

11、達(dá)EGFP的TM4細(xì)胞增多，熒光亮度增強(qiáng)。因而將慢病毒感染TM4細(xì)胞的MOI 設(shè)立為100。根據(jù)2－△△Ct的方法相對(duì)定量，TM4-Lenti6/TR細(xì)胞中TetR基因的表達(dá)量為正常TM4細(xì)胞的27301.01 倍，而TM4-Lenti6/TR&Lenti4-sh細(xì)胞中TetR基因和抗性基因表達(dá)量分別正常TM4細(xì)胞的406623.29 倍和51212760.84 倍。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的含有Tet 調(diào)控元件的uP

12、A 干擾載體。經(jīng)TM4細(xì)胞感染和抗性篩選后，建立了TetR 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株TM4-Lenti6/TR和雙穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株TM4-Lenti6/TR&Lenti4-sh。
　　 第三部分可誘導(dǎo)的RNAi 調(diào)控uPA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究目的：利用第二部分實(shí)驗(yàn)中獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和攜帶uPA 干擾載體的慢病毒液，構(gòu)建體外細(xì)胞培養(yǎng)體系和小鼠在體動(dòng)物模型，通過Dox 給藥，觀察雙穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和小鼠睪丸組織uPA mRNA和蛋白表達(dá)情況以及uPA 酶活性的改變

13、，評(píng)估Dox 對(duì)uPA的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　 方法：通過MTT 實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度Dox 對(duì)TM4細(xì)胞的毒性，篩選Dox 作用安全劑量。在此基礎(chǔ)上，將第二部分獲得的雙穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株TM4-Lenti6/TR& Lenti4-sh 進(jìn)行體外培養(yǎng)，以TetR 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株TM4-Lenti6/TR和TM4細(xì)胞作為對(duì)照，通過Dox 誘導(dǎo)，在24 h、48 h、72 h 觀察各組細(xì)胞uPA mRNA和蛋白表達(dá)的抑制情況以及細(xì)胞培養(yǎng)液中uPA 酶活性

14、的改變，評(píng)估Dox的體外誘導(dǎo)效應(yīng)。在Dox 作用72 h后，移除Dox，觀察移除24 h、48 h、72 h后uPA mRNA和蛋白表達(dá)的恢復(fù)情況。將慢病毒液Lenti4-sh和Lenti6/TR 經(jīng)皮睪丸注射，構(gòu)建小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停宰⑸銵enti6/TR 慢病毒液和生理鹽水的小鼠作為對(duì)照，通過Dox 灌胃進(jìn)行體內(nèi)誘導(dǎo)，在Dox 作用24 h、48 h、72 h和1周后觀察各組小鼠睪丸組織uPA mRNA和蛋白的表達(dá)情況以及睪丸組織勻漿液

15、uPA 酶活性變化。
　　 結(jié)果：MTT 實(shí)驗(yàn)篩選得出Dox 作用于TM4細(xì)胞的安全濃度在5μg/ml以下。以1 μg/ml的Dox 對(duì)TM4-TetR&shuPA、TM4-TetR和TM4細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，后兩組細(xì)胞uPA表達(dá)在誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組間無明顯差異，而TM4-TetR&shuPA 雙穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組的uPA mRNA在Dox 誘導(dǎo)24 h后即較非誘導(dǎo)組有明顯下降，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長，抑制作用更為明顯，作用72 h 時(shí)

16、，誘導(dǎo)組表達(dá)量僅為非誘導(dǎo)組的35％。uPA蛋白表達(dá)變化較mRNA 出現(xiàn)略晚，在Dox 誘導(dǎo)72 h后，蛋白表達(dá)較非誘導(dǎo)組顯著降低。S-2251 發(fā)色底物法檢測結(jié)果示，雙穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞誘導(dǎo)組uPA 酶活性在72 h 時(shí)明顯降低，為非誘導(dǎo)組的65.1％。隨著Dox 從細(xì)胞培養(yǎng)液的移除，uPA表達(dá)逐漸恢復(fù)，移除48 h后，uPAmRNA和蛋白表達(dá)水平與非誘導(dǎo)組無顯著性差異。雄性小鼠經(jīng)皮睪丸內(nèi)注射慢病毒載體后，以0.75mg/ml的Dox 進(jìn)行誘導(dǎo)，

17、結(jié)果表明，TetR&shuPA 小鼠在Dox 作用24 h后，uPA mRNA 水平較非誘導(dǎo)組以及對(duì)照組明顯降低，隨Dox 作用時(shí)間的延長，uPA mRNA的表達(dá)逐漸減少，Dox 作用1周后，抑制作用最為明顯，uPA mRNA表達(dá)水平與誘導(dǎo)24 h 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。uPA蛋白與mRNA表達(dá)情況略有不同，在Dox 作用的72 h 內(nèi)，TetR&shuPA 小鼠睪丸uPA蛋白與非誘導(dǎo)組表達(dá)水平相接近，而在Dox 作用1周后，uPA

18、蛋白表達(dá)水平在誘導(dǎo)組出現(xiàn)了明顯下降，與非誘導(dǎo)組有顯著差異。
　　 結(jié)論：Dox 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)體系和小鼠睪丸組織內(nèi)的uPA表達(dá)均有調(diào)控作用，其抑制uPA表達(dá)在體外體系可維持至72 h，移除Dox后，uPA表達(dá)水平在48 h 內(nèi)逐漸恢復(fù)。
　　 小鼠在體模型中，Dox 誘導(dǎo)可以下調(diào)睪丸組織中uPA表達(dá)水平以及勻漿液uPA 酶活性，抑制作用至誘導(dǎo)1周最為明顯。
　　 第四部分調(diào)控uPA表達(dá)影響雄性小鼠生育力的實(shí)驗(yàn)研究目的

19、：通過第三部分動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，觀察睪丸uPA表達(dá)受到可誘導(dǎo)的RNAi調(diào)控后，雄性小鼠生育力、精子功能的改變，分析uPA 影響雄性小鼠生育力的可能機(jī)制。
　　 方法：慢病毒液經(jīng)皮睪丸注射構(gòu)建雄性小鼠動(dòng)物模型，Dox 灌胃1周后行交配實(shí)驗(yàn)，觀察雄鼠交配率、交配雌鼠妊娠率、平均胚胎數(shù)和黃體數(shù)。解剖雄鼠，測定附睪精子活動(dòng)百分率和存活率，低滲腫脹實(shí)驗(yàn)觀察精子膜功能。小鼠睪丸附睪取材，光鏡和透射電鏡觀察組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變，并觀察動(dòng)物生

20、殖系統(tǒng)外其他組織器官病理變化。分別在Dox 停藥2周、4周和8周再次與雌鼠交配，觀察雄鼠生育力和精子功能的恢復(fù)情況。
　　 結(jié)果：Dox 給藥1周后各組小鼠交配率無明顯差異。TetR&shuPA 小鼠誘導(dǎo)組雌鼠妊娠率和平均胎數(shù)較非誘導(dǎo)組和空白對(duì)照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），平均黃體數(shù)無顯著性差異。停藥2周后，TetR&shuPA 誘導(dǎo)組雌鼠妊娠率和平均胎數(shù)明顯增加，至停藥8周時(shí)，雌鼠妊娠率和平均胎數(shù)與非誘導(dǎo)組

21、和空白對(duì)照組水平相當(dāng)。Dox 誘導(dǎo)后，各組小鼠的精子存活率和精子低滲腫脹率均無明顯差異。TetR&shuPA 小鼠活動(dòng)精子百分率較非誘導(dǎo)組和空白對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）。隨Dox 停藥時(shí)間的延長，TetR&shuPA 誘導(dǎo)組小鼠精子活力逐漸恢復(fù)，至停藥8周時(shí)，誘導(dǎo)組小鼠精子活力恢復(fù)至空白對(duì)照組水平。Dox 用藥后，各組小鼠睪丸附睪組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)未見明顯病理改變。實(shí)驗(yàn)組小鼠其他組織器官未見病理性結(jié)構(gòu)損傷。
　　 結(jié)論：D