兔緩慢性心律失常模型建立與MSCs同種異體心臟移植后細(xì)胞整合及功能研究.pdf

1、研究背景與目的：病態(tài)竇房結(jié)綜合征(病竇綜合征)是一種常見臨床疾病，該疾病對(duì)人類健康危害很大。目前，關(guān)于病竇綜合征的發(fā)病機(jī)理可能有以下幾種：1)退行性變；2)心肌??；3)心肌炎癥；4)手術(shù)損傷等，植入永久性人工電子心臟起搏器仍然是目前臨床上主要的治療手段。電子心臟起搏器有一些固有缺陷，如：電池壽命有限、需要定期檢測(cè)及更換，價(jià)格昂貴，可能發(fā)生電極斷裂及全身嚴(yán)重感染等并發(fā)癥。因此，探討如何建立一個(gè)具有正常生理起搏功能的“生物起搏器”替代竇房結(jié)

2、或者其他傳導(dǎo)系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)揮功能，從而避免永久性人工電子心臟起搏器植入，已經(jīng)成為目前心臟電生理學(xué)界研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)內(nèi)容之一，部分學(xué)者在以基因治療和細(xì)胞移植技術(shù)為平臺(tái)構(gòu)建心臟生物起搏器治療緩慢性心律失常方面進(jìn)行了不少有益的探索。部分研究將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)經(jīng)基因修飾后移植或者直接移植、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells)體外誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞進(jìn)行移植或者成體心肌細(xì)胞直接

3、移植至生物體內(nèi)試圖建立新的心臟起搏點(diǎn)，但其結(jié)果并不十分理想，其主要問(wèn)題包括：1)胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)問(wèn)題；2)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)不成熟；3)心率偏慢、移植細(xì)胞體內(nèi)存活時(shí)間不確定以及較低的心率變異性；4)成體心肌細(xì)胞來(lái)源比較困難等。
　　 超極化激活的環(huán)核苷酸門控的陽(yáng)離子通道(hyperpolarization activated cyclicnucleotide gated cation channel，HCN)基因是起搏離子流(

4、funny current，If)的分子基礎(chǔ)；HCN基因家族四個(gè)成員HCN1～HCN4中HCN4基因與If的形成關(guān)系最為密切。近年來(lái)的研究已經(jīng)證實(shí)起搏電流If在調(diào)控心臟和神經(jīng)元的自發(fā)起搏活動(dòng)中起著非常重要的作用。目前正在進(jìn)行的以基因治療和細(xì)胞移植技術(shù)為平臺(tái)構(gòu)建心臟生物起搏器治療緩慢性心律失常的研究中，HCN通道基因已成為備受重視的備選基因。在已克隆的4種HCN基因亞型中，HCN4主要分布于心臟的特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)組織中。既往研究均選用大型實(shí)驗(yàn)

5、動(dòng)物犬/豬，采用射頻消融法獲得永久性三度房室傳導(dǎo)阻滯模型，所選靶基因多為HCN2基因，本研究旨在探討經(jīng)化學(xué)消融竇房結(jié)的基礎(chǔ)上行雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激制備一過(guò)性兔緩慢性心律失常模型，觀察mHCN4基因修飾的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植至兔左室游離壁心外膜下之后的在體整合及起搏功能情況，為探討與完善生物起搏治療提供新的研究思路與方法。
　　 方法：
　　 1.取2月齡日本大耳白兔無(wú)菌條件下行股骨粗隆穿刺抽取骨髓，采用Percoll梯度密

6、度離心法洗滌離心2遍后，收集中間層呈云霧狀白膜的單個(gè)核細(xì)胞層，用DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，加入胎牛血清(10％)的DMEM培養(yǎng)基中按照10×108/ml常規(guī)行接種、培養(yǎng)及傳代。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代兔MSCs細(xì)胞按2×104/孔的接種密度接種于24孔板中，將培養(yǎng)基與含有pMSCV-mHCN4-EGFP的病毒上清按1:1比例稀釋后加入鋪板的兔MSCs細(xì)胞中，并加入polybrene(終濃度調(diào)至2μg/ml)。轉(zhuǎn)染24 h后，用2μg/ml

7、的嘌呤霉素加壓篩選培養(yǎng)10～15天，即可獲得mHCN4感染陽(yáng)性的兔MSCs。免疫熒光法檢測(cè)空白對(duì)照、EGFP組及mHCN4組細(xì)胞目的基因表達(dá)情況。以膜片鉗技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染表達(dá)的mHCN4通道進(jìn)行電生理學(xué)測(cè)定。
　　 2.采用化學(xué)消融兔竇房結(jié)的基礎(chǔ)上雙側(cè)迷走神經(jīng)程序刺激法制備一過(guò)性緩慢性心律失常模型?；瘜W(xué)消融方案：以干棉簽拭干右心耳和上腔靜脈交界處區(qū)域(即SAN區(qū))，用大小約5 mm×5 mm×5 mm棉簽蘸取20％的甲醛溶液置于SAN

8、區(qū)濕敷。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ECG變化情況并記錄HR變化，以濕敷后HR下降超過(guò)30％或者出現(xiàn)交界性逸搏、竇性停搏為消融成功標(biāo)準(zhǔn)，停止?jié)穹螅掷m(xù)監(jiān)測(cè)ECG至少2 h，如ECG顯示心率/節(jié)律出現(xiàn)反復(fù)，則再次行甲醛濕敷直至達(dá)標(biāo)為止。迷走刺激方案：采用頻率分級(jí)遞增法進(jìn)行單/雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激。選取刺激電壓4～6V，刺激頻率依次為：2.5Hz、5Hz、10Hz、15Hz以及20Hz(1Hz=60次/分)。先行2.5Hz刺激，時(shí)間不超過(guò)60s，經(jīng)刺激達(dá)到刺激終點(diǎn)

9、時(shí)對(duì)觀察指標(biāo)進(jìn)行記錄；如刺激60s仍沒有達(dá)到刺激終點(diǎn)，則增加刺激頻率進(jìn)入下一檔刺激。兩次刺激間隔時(shí)間不少于180s。以此類推。達(dá)到刺激終點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)兔在間隔180s后行120s持續(xù)刺激。
　　 3.移植后3天、1周、2周及4周分別于麻醉下化學(xué)消融竇房結(jié)后程序刺激雙側(cè)迷走神經(jīng)，觀察有無(wú)左室移植細(xì)胞來(lái)源的早搏或室性節(jié)律。術(shù)后取材行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，DAB顯色檢測(cè)縫隙連接蛋白表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)EGFP及mHCN4基因表達(dá)。
　　

10、 結(jié)果：
　　 1.成功將攜帶mHCN4基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)轉(zhuǎn)染至兔MSCs，經(jīng)2μg/mL的嘌呤霉素加壓篩選后獲得了可穩(wěn)定表達(dá)mHCN4基因的兔MSCs。
　　 2.轉(zhuǎn)染mHCN4基因的兔MSCs可以記錄到具有明顯時(shí)間及電壓依賴特性的對(duì)細(xì)胞外Cs+敏感的超極化激活的內(nèi)向電流，其在-140mV指令電壓下的平均電流密度為-42.8±3.6pA/pF；在指令電壓的末端去極化至+20mV時(shí)

11、可以記錄到明顯的尾電流；而EGFP對(duì)照組未能檢測(cè)到明顯的超極化內(nèi)向電流。
　　 3.經(jīng)化學(xué)消融竇房結(jié)后實(shí)驗(yàn)兔基礎(chǔ)心率顯著下降(307±21次/分 vs126±28次/分，p<0.01)。以不同頻率刺激右側(cè)迷走神經(jīng)均表現(xiàn)為心率減慢，刺激左側(cè)迷走神經(jīng)也以心率減慢為主，隨刺激頻率增加可出現(xiàn)竇性停搏及交界性逸搏心律。以10Hz以上刺激頻率同時(shí)刺激雙側(cè)迷走神經(jīng)可以出現(xiàn)竇性停搏及室性逸搏，部分出現(xiàn)3度房室傳導(dǎo)阻滯。隨著雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激頻率的

12、增加，達(dá)到刺激終點(diǎn)所需的刺激時(shí)間逐漸縮短。所有實(shí)驗(yàn)兔在終止刺激后均能逐漸恢復(fù)刺激前竇性節(jié)律，但恢復(fù)時(shí)間隨刺激頻率增加而延長(zhǎng)。
　　 4.經(jīng)化學(xué)消融竇房結(jié)基礎(chǔ)上迷走神經(jīng)刺激抑制竇性節(jié)律條件下，移植后3天時(shí)各組實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)的室性逸搏心率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；移植后1周mHCN4組僅有1只出現(xiàn)高于對(duì)照組及EGFP組心率的移植細(xì)胞來(lái)源的室性節(jié)律；移植后2周及4周時(shí)，mHCN4組室性心率顯著高于對(duì)照組及EGFP組，QRS波時(shí)間也顯著短于對(duì)照組及EG

13、FP組。
　　 5.隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞移植區(qū)HE染色呈現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)演變：移植后3天時(shí)移植細(xì)胞多為圓形并成簇聚集，與周圍正常心室肌界限明顯；移植后1周時(shí)移植細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與正常心室肌相鄰處可見少量細(xì)胞呈短梭形；移植后2周時(shí)移植細(xì)胞與周圍心室肌過(guò)渡較為自然，梭形細(xì)胞數(shù)量增多；移植后4周時(shí)存活移植細(xì)胞形態(tài)基本呈長(zhǎng)梭形，與周圍心室肌界限較模糊。對(duì)照組注射等體積培養(yǎng)基后移植部位組織切片HE染色表現(xiàn)為輕微炎癥反應(yīng)，動(dòng)態(tài)演變不明顯。DAB

14、顯色可見移植細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間CX43、CX45均有表達(dá)，呈褐色，線、顆粒狀。
　　 6.移植細(xì)胞在移植術(shù)后3d時(shí)即可檢出EGFP和mHCN4陽(yáng)性表達(dá)，但細(xì)胞基本呈圓形，尚未伸展開，CX43、CX45表達(dá)為陰性。移植后1周時(shí)存活細(xì)胞減少，少量細(xì)胞呈短梭形，EGFP、mHCN4及CX43、CX45表達(dá)均為陽(yáng)性。移植后2周時(shí)移植細(xì)胞伸展為長(zhǎng)梭形，形態(tài)接近于相鄰心室肌細(xì)胞，可見移植細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間CX43、CX45陽(yáng)性表達(dá)。移植后4

15、周時(shí)鏡下表現(xiàn)與移植后2周相似。
　　 結(jié)論：
　　 1.mHCN4基因可成功轉(zhuǎn)染至兔MSCs，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選后可穩(wěn)定表達(dá)。
　　 2.mHCN4基因轉(zhuǎn)染修飾的兔MSCs可成功記錄到If電流，具備心臟起搏細(xì)胞的電生理特性。
　　 3.采用化學(xué)消融竇房結(jié)基礎(chǔ)上雙側(cè)迷走神經(jīng)刺激法可以成功制備緩慢性心律失常模型，能夠滿足生物起搏在體實(shí)驗(yàn)研究要求。
　　 4.mHCN4基因修飾的兔MSCs左室游離壁心外