生物芯片和納米中藥對肝膽腫瘤早期診治的研究.pdf

1、第一部分生物芯片早期診斷肝膽腫瘤的探討
　　PartⅠMeDIP芯片分析和建立膽管癌差異甲基化譜
　　目的:利用全基因組啟動子區(qū)CpG島甲基化位點檢測芯片技術(shù),分析人膽管癌細(xì)胞株與人正常膽管上皮細(xì)胞株間的基因甲基化差異,建立膽管癌基因差異甲基化譜,為尋找特異性膽管癌早期診斷標(biāo)志物奠定。
　　方法:采用NimbleGenHG18CpGPromoter芯片(Roche,Germany)分別檢測人膽管癌細(xì)胞株TFK-1和人正

2、常膽管上皮細(xì)胞株BEC全基因組啟動子區(qū)CpG島甲基化位點,并分析比較兩細(xì)胞株間的差異甲基化位點。并應(yīng)用MolecularAnnotationSystem(MAS)軟件分析差異甲基化位點對應(yīng)的基因的功能。采用亞硫酸氫鹽測序法(BSP)檢測HOX基因甲基化水平。采用熒光定量PCR和western-blot法檢測目的基因在細(xì)胞水平的表達(dá)情況。免疫組化檢測目的基因在膽管癌和癌旁組織中的表達(dá)差異。甲基化PCR(MSP)檢測甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑干預(yù)前后

3、,目的基因甲基化的變化情況。
　　結(jié)果:1.MeDIP芯片結(jié)果顯示:相比于BEC細(xì)胞株TFK-1細(xì)胞株中有2103個CpG島表現(xiàn)為差異性高甲基化;
　　2.在所有差異性高甲基化CpG島中有97個基因?qū)儆贖OX家族基因,這些基因涉及細(xì)胞分化、周期改變、粘附、侵襲與轉(zhuǎn)移以及血管生成等多個腫瘤發(fā)生機制;
　　3.SignalMap軟件分析這97個HOX家族基因,發(fā)現(xiàn)甲基化率最高的前15位基因是HOXA5、HOXA2、HOXA

4、11、HOXB4和HOXD13。BSP證實其各自的甲基化率為:HOXA5(95.38％)、HOXA2(94.29%)、HOXA11(91.67%)、HOXB4(90.56%)和HOXD13(94.38%);
　　4.PCR和Western-blotting結(jié)果顯示:在肝癌、膽管癌、胰腺癌和大腸癌等消化道腫瘤細(xì)胞株中,膽管癌細(xì)胞株TFK-1中HOXA5表達(dá)量最低。免疫組化顯示:相比于癌旁和正常膽管組織而言,膽管癌中HOXA5表達(dá)量明

5、顯降低。MSP證實:在甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑干預(yù)后,HOXA5在TFK-1中甲基化程度明顯降低。
　　結(jié)論:1.MeDIP芯片是篩選膽管癌早期診斷標(biāo)志物的有效方法之一;
　　2.DNA甲基化可能是HOXA5在膽管癌中表達(dá)降低的重要原因,且HOXA5高甲基化可作為膽道腫瘤的早期診斷標(biāo)志物之一。
　　PartⅡ無透鏡顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞診斷芯片集成系統(tǒng)的構(gòu)建
　　目的:微流控芯片實驗室(Lab-on-a-chip)技術(shù)越來越多地

6、用于細(xì)胞毒性檢測和藥物測試。該技術(shù)主要利用蝕刻技術(shù)到以各種材料制作的芯片上的通道和孔洞構(gòu)成的“網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建微型實驗室。實際應(yīng)用時,壓力以精細(xì)控制的方式推動鈉升的體積流過通道,從而實現(xiàn)在單個集成的系統(tǒng)上進行樣品處理、混合、稀釋、電泳、定點追蹤以及色譜分析、染色和檢測。本實驗的目的是利用德國IBMT研究所先進的芯片實驗室,構(gòu)建一種方便攜帶使用、成本低廉、快速分析、樣本和試劑消耗少的細(xì)胞診斷芯片。
　　方法:本實驗利用接觸式光學(xué)平板印刷技

7、術(shù)的原理構(gòu)建了一種無透鏡熒光顯微鏡/光學(xué)顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞芯片集成系統(tǒng)。生物樣本被放置在一個包含有一個1.5μl漏斗狀的腔及底部為1μm厚的硅氮化合物的MEMS芯片內(nèi)。再將芯片裝載在一個5兆彩色CMOS成像元件陣列上,最后在兩者間覆蓋一個光濾片。利用此系統(tǒng)培養(yǎng)鼠源性纖維細(xì)胞L929和人膽管癌細(xì)胞TFK-1。同時,分別用ErythrosineB和FITC進行細(xì)胞染色處理后,再比較此系統(tǒng)與傳統(tǒng)熒光顯微鏡的成像效果。
　　結(jié)果:1.該系統(tǒng)監(jiān)

8、測L929細(xì)胞及TFK-1細(xì)胞影像的對比度和清晰度與4x物鏡下的影像基本一致;
　　2.定點追蹤觀察單個或少量細(xì)胞形態(tài)變化,效果良好;
　　3.L929經(jīng)紅染或綠色熒光染色后,該系統(tǒng)顯示細(xì)胞形態(tài)清晰。
　　結(jié)論:該組件可用于動態(tài)定點監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞的熒光圖像,為后期診斷芯片的進一步開發(fā)提供重要的參考數(shù)據(jù)。
　　第二部分雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒治療肝膽腫瘤的實驗研究
　　PartⅠ地西他濱和丙戊酸鈉單

9、用對人膽管癌生長抑制作用研究
　　目的:探討地西他濱(DAC)和丙戊酸鈉(VPA)單用對人膽管癌細(xì)胞株TFK-1、QBC939、HUCCT、CCLP1細(xì)胞增殖的影響,并探討其可能的機制。
　　方法:1.采用CCK8法檢測DAC、VPA單獨使用時對細(xì)胞生長的抑制率;
　　2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測DAC、VPA單獨使用后細(xì)胞周期的變化;
　　3.經(jīng)Hochst33342/PI染色,光鏡下觀察經(jīng)DAC、VPA單獨使用后細(xì)

10、胞形態(tài)的變化,同時應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測處理后細(xì)胞凋亡情況;
　　4.光鏡下觀察經(jīng)DAC、VPA單獨使用細(xì)胞120h后,細(xì)胞分化的情況;
　　5.構(gòu)建GFP-LC3質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,再加入DAC、VPA單獨使用處理72小時,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬情況;
　　6.體內(nèi)實驗采用裸鼠TFK-1細(xì)胞皮下種植瘤模型,觀察DAC、VPA單獨使用對瘤體生長及生存率的影響。
　　結(jié)果:1.DAC、VPA單獨使用對人膽管癌細(xì)胞的增殖抑制

11、作用呈時間和劑量依賴性;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,膽管癌細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的G2/M或G0/G1期阻滯;
　　3.經(jīng)DAC、VPA單獨使用后,光鏡下可見凋亡的細(xì)胞呈明顯的胞體固縮、核固縮、核碎裂及凋亡小體形成。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明:細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性;
　　4.光鏡下觀察到DAC、VPA單獨使用120h后,細(xì)胞形態(tài)呈樹突狀突起;
　　5.熒光顯微鏡下觀察到DAC、VPA單獨使用后

12、,細(xì)胞有明顯的自噬現(xiàn)象;
　　6.體內(nèi)試驗證明:當(dāng)應(yīng)用DAC或VPA后,總給藥時間為2周時,其對裸鼠TFK-1細(xì)胞皮下移植瘤的生長有明顯的抑制作用。而且,治療組的裸鼠生存期較對照組明顯延長。
　　結(jié)論:體外實驗和體內(nèi)實驗均證實,DAC或VPA對膽管癌細(xì)胞均具有明顯的生長抑制作用。
　　PartⅡ雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒對肝癌生長抑制的研究
　　目的:1.觀察雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒(TP-SLN)經(jīng)尾靜脈注射

13、給藥對SPF級BALB/C小鼠的急性毒性研究;
　　2.觀察TP-SLN對肝癌細(xì)胞株H22體外和荷瘤體內(nèi)的抗腫瘤作用研究
　　方法:1.雷公藤內(nèi)酯醇(TP)和TP-SLN分別作用于H22細(xì)胞24h、48h和72h后,CCK-8法檢測細(xì)胞的存活率;
　　2.SPF級BALB/c小鼠50只(雌雄各半),按照0.65mg/kg,0.773mg/kg,0.919mg/kg,1.189mg/kg,1.300mg/kg單次尾靜脈注

14、射給予TP-SLN,共5個劑量組。觀察小鼠單次給藥的癥狀體征,統(tǒng)計死亡率、體重等相應(yīng)指標(biāo)的變化;
　　3.建立H22細(xì)胞BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,分為生理鹽水空白對照組,空白固體脂質(zhì)納米粒組,雷公藤內(nèi)酯醇(TP)組,TP-SLN組,順鉑陽性對照組,隔日尾靜脈給藥后觀察記錄腫瘤的體積、體重、一般生長活動狀況。12天后處死所有小鼠,剝離腫瘤組織進行稱重。
　　結(jié)果:1.體外實驗中,TP-SLN對H22細(xì)胞生長抑制呈時間和劑

15、量依賴性,作用明顯且強于TP;
　　2.TP-SLN對于SPF級BALB/c小鼠尾靜脈注射途徑而言,其LD50值為0.891mg/kg,95%的可置信區(qū)間是0.814mg/kg—0.971mg/kg。并且在該劑距范圍內(nèi),TP-PM對于BALB/c小鼠而言,死亡率呈現(xiàn)良好劑量效應(yīng)關(guān)系;觀察發(fā)現(xiàn):TP-PM對于SPF級BALB/c小鼠而言,在注射后的4hrs內(nèi)小鼠均未出現(xiàn)死亡,隨著時間的延長,部分小鼠癥狀逐漸加重抖動,共濟失調(diào),進而活

16、動減少,活動抑制直至死亡;BALB/c小鼠死亡時間集中在24-48hrs,96hrs后絕大部分存活動物恢復(fù)正常的運動、呼吸等,體重上升。
　　3.與生理鹽水空白對照組比較,TP、TP-SLN及順鉑均引起腫瘤體積下降和體重減輕。抑瘤率分別為22.4%、49.2%、51.5%。TP、TP-SLN與生理鹽水空白對照組相比,小鼠的生活狀態(tài)(體重、反應(yīng)能力等)均有一定的改善。順鉑組生活狀態(tài)無明顯改善。
　　結(jié)論:與TP相比,TP-SL

17、N體內(nèi)、外對肝癌細(xì)胞的抑制增強且穩(wěn)定、持久,副作用減弱。
　　PartⅢ地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉增強TP-SLN對人膽管癌細(xì)胞生長抑制作用的初步研究
　　目的:探討DAC聯(lián)合VPA能否增強TP-SLN對人膽管癌細(xì)胞殺傷作用。
　　方法:DAC聯(lián)合VPA預(yù)處理TFK-1細(xì)胞3天后,再加入TP-SLN處理24h、48h和72h,采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果:與未預(yù)處理組相比,地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉預(yù)處理后,T

18、P-SLN對人膽管癌細(xì)胞增值抑制作用明顯增強
　　結(jié)論:地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉預(yù)處理增強TP-SLN對人膽管癌細(xì)胞增值抑制效應(yīng)。
　　第三部分應(yīng)用無透鏡顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞診斷芯片集成系統(tǒng)初探納米中藥對膽管癌細(xì)胞作用機制
　　目的:應(yīng)用無透鏡顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞診斷芯片集成系統(tǒng)觀察納米中藥與膽管癌細(xì)胞間相互作用
　　方法:應(yīng)用無透鏡顯微鏡聯(lián)合細(xì)胞診斷芯片集成系統(tǒng)培養(yǎng)TFK-1細(xì)胞72小時后,培養(yǎng)基中加入TP-SLN,采集處理2