黏膜型肥大細(xì)胞與結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)展關(guān)系的研究.pdf

1、炎癥是腫瘤的重要組成部分，大約四分之一的腫瘤起源于慢性炎癥[Grivennikov et al.，2010]，例如炎性腸?。冃越Y(jié)腸炎和克羅恩?。┫嚓P(guān)結(jié)腸癌[Mantovani et al.，2008]。慢性炎癥微環(huán)境中浸潤的大量炎性細(xì)胞在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用，其中包含大量固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。參與一線防御反應(yīng)的肥大細(xì)胞的促瘤作用已在人類和小鼠結(jié)腸癌中得到證實(shí)，然而人和小鼠肥大細(xì)胞至少存在兩個(gè)亞群，目前的研究

2、主要關(guān)注結(jié)締組織型肥大細(xì)胞(CTMC)，而較少關(guān)注黏膜型肥大細(xì)胞(MMC)。本研究通過藥物阻斷黏膜型肥大細(xì)胞活化，探索黏膜型肥大細(xì)胞在結(jié)腸炎向結(jié)腸癌惡性轉(zhuǎn)化過程的作用，并探討潛在的機(jī)制。
　　本課題使用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸癌模型，留取AD1、AD2、AD3期升、降結(jié)腸組織及同齡小鼠全結(jié)腸組織。前期mRNA表達(dá)的組織芯片分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎向結(jié)腸癌發(fā)展過程中，肥大細(xì)胞相關(guān)蛋白酶(MCPs)轉(zhuǎn)錄豐度逐漸增加，AD3期達(dá)最高，其中

3、MMC特異性蛋白酶(mMCP-1，mMCP-2)增加幅度最大;qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)了組織芯片結(jié)果;甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)不同時(shí)期肥大細(xì)胞的變化，mMCP-1免疫組化染色分析MMC數(shù)目的變化。以上數(shù)據(jù)提示結(jié)腸炎向結(jié)腸癌發(fā)展過程中，結(jié)腸組織MMC數(shù)量逐漸增多。隨后我們使用藥物阻斷肥大細(xì)胞，選取主要作用于MMC的色甘酸二鈉(DSCG)及特異性針對(duì)CTMC的酮替芬(Ketotifen)，在DSS間歇期灌胃給藥2周，至AD3期，并評(píng)估結(jié)腸腫瘤發(fā)展情況

4、。炎癥發(fā)生前給予DSCG阻斷肥大細(xì)胞活化，在5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)處置小鼠，收集標(biāo)本待檢測(cè)，并在第14周評(píng)估MMC阻斷情況:甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)結(jié)腸組織肥大細(xì)胞數(shù)目、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)腸組織MMC數(shù)目、ELISA檢測(cè)血清mMCP-1水平、qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織mMCPs轉(zhuǎn)錄水平;隨后評(píng)估結(jié)腸腫瘤發(fā)展情況。同時(shí)探討了MMC發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，分析不同時(shí)間點(diǎn)血清mMCP-1的水平及結(jié)腸上皮內(nèi)細(xì)胞中CD11b+Gr-1+MDSCs數(shù)量的變化。

5、　　結(jié)腸上皮不典型增生期是結(jié)腸炎向結(jié)腸癌惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期，基于以上研究，我們于不典型增生期阻斷肥大細(xì)胞活化進(jìn)行治療，即在第10周給予AOM/DSS小鼠1周DSCG或3天Doxantrazole（非選擇性肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑），并設(shè)置相應(yīng)溶劑對(duì)照組。評(píng)估肥大細(xì)胞阻斷情況:甲苯氨藍(lán)染色檢測(cè)肥大細(xì)胞數(shù)目，ELISA檢測(cè)血清及結(jié)腸組織間液mMCP-1水平，隨后評(píng)估結(jié)腸腫瘤情況。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，mMCP-1可能與CD11b+Gr-1+MDSCs的

6、募集有重要關(guān)聯(lián)。健康小鼠腹腔注射不同濃度mMCP-1及生理鹽水，24 hr后行腹腔盥洗收獲細(xì)胞，流式染色分析CD11b+Gr-1+細(xì)胞比例的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:從AD1到AD3期，結(jié)腸組織MMC數(shù)目逐漸增加，AD3期最多。AOM注射兩天之后，損傷結(jié)腸組織肥大細(xì)胞迅速募集。炎癥發(fā)生前給DSCG可顯著阻斷黏膜型肥大細(xì)胞:黏膜型肥大細(xì)胞數(shù)目減少;血清mMCP-1水平顯著下降;mMCP-1和mMCP-2轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，而結(jié)締組織型肥大

7、細(xì)胞相關(guān)基因(Cpa3，mMCP-4，mMCP-6)轉(zhuǎn)錄水平則無顯著差異;同時(shí)結(jié)腸腫瘤數(shù)目、大小及負(fù)荷均顯著減少，且結(jié)腸的縮短程度較Sham組有明顯改善。結(jié)腸上皮不典型增生期藥物阻斷MMC情況:治療組肥大細(xì)胞數(shù)目明顯較其溶劑對(duì)照組減少;治療組血清及結(jié)腸組織間液mMCP-1水平均明顯下降;治療組腫瘤數(shù)目、結(jié)腸重量顯著減少。15ng/ml mMCP-1可顯著增加腹腔CD11b+Gr-1+細(xì)胞的募集。第14周DSCG組小鼠結(jié)腸組織、脾臟及腸系