IGF-1緩解紫杉醇誘發(fā)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元毒性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、紫杉醇(paclitaxel，PT)是臨床上常用的抗腫瘤藥物，具有很好的抗腫瘤治療效果，但PT的神經(jīng)毒性作用或PT誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變可使病人出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)病理性疼痛癥狀，而且這種疼痛癥狀用常規(guī)的鎮(zhèn)痛藥物難以緩解，嚴(yán)重影響進(jìn)一步抗腫瘤治療。到目前為止，PT的神經(jīng)毒性作用或PT誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制還未完全被闡明。PT誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛癥狀與背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)初級傳入神經(jīng)元的毒性有關(guān)。因此，研

2、究PT對DRG神經(jīng)元表型變化的影響對于闡明PT的神經(jīng)毒性作用機(jī)制具有一定的指導(dǎo)意義，探討緩解PT的神經(jīng)毒性作用有助于開發(fā)PT誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變新的治療手段。本研究利用體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元和PT誘發(fā)的大鼠周圍神經(jīng)病變模型研究胰島素樣生長因子-1（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）緩解PT誘發(fā)的神經(jīng)毒性及其機(jī)制。
　　第一部分IGF-1對具有紫杉醇毒性的培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　根據(jù)

3、神經(jīng)生化免疫反應(yīng)的特殊標(biāo)記可將DRG神經(jīng)元分為神經(jīng)肽免疫反應(yīng)（neuropeptide-immunoreactive，NP-IR）和神經(jīng)絲免疫反應(yīng)(neurofilament-IR，NF-IR)神經(jīng)元兩種主要表型。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitoningene-relatedpeptide，CGRP）是一種在DRG神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮多種生物學(xué)功能的感覺神經(jīng)肽，CGRP-IR神經(jīng)元可代表NP-IR神經(jīng)元。神經(jīng)絲(neurofilament

4、，NF)是神經(jīng)元特異性中間絲，其中神經(jīng)絲蛋白-200（neurofilament-200，NF-200）對正常神經(jīng)元的維持發(fā)揮重要作用，NF-200-IR神經(jīng)元可代表NF-IR神經(jīng)元。PT是否能夠影響DRG神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)表型目前仍不清楚。
　　IGF-1是一種促生長的肽類激素，通過激活其酪氨酸激酶受體IGF-1R促進(jìn)神經(jīng)元的存活。IGF-1及其受體IGF-1R均在DRG神經(jīng)元有表達(dá)，IGF-1在促進(jìn)DRG神經(jīng)元軸突的生長及調(diào)控感

5、覺神經(jīng)肽的表達(dá)方面發(fā)揮重要作用。IGF-1是否通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellularsignal-regulatedproteinkinase1/2，ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threoninekinase，Akt)信號通路調(diào)節(jié)PT誘發(fā)的DRG神經(jīng)元的表型變化尚需進(jìn)一步探討。
　　為了檢測PT神經(jīng)

6、毒性作用的劑量依賴關(guān)系，將原代培養(yǎng)48h的DRG神經(jīng)元分為以下各組:(1)PT0.01μmol/L;(2)PT0.1μmol/L;(3)PT1μmol/L;(4)對照組:DRG神經(jīng)元僅在培養(yǎng)液內(nèi)孵育作為對照。DRG神經(jīng)元在以上條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在倒置相差顯微鏡下觀察DRG神經(jīng)元活細(xì)胞生長狀態(tài)，用微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associatedprotein2，MAP2)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記后測量單個神經(jīng)元突起的長度。結(jié)果

7、顯示，DRG神經(jīng)元突起長度的縮短與PT的濃度具有劑量依賴性。
　　為了檢測IGF-1對具有PT毒性的DRG神經(jīng)元的保護(hù)作用，將原代培養(yǎng)48h的DRG神經(jīng)元分為以下各組:(1)PT(1μmol/L);(2)PT(1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(3)ERK1/2抑制劑PD98059(10μmol/L)+PT(1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(4)PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)+

8、PT(1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(5)對照組:DRG神經(jīng)元僅在培養(yǎng)液內(nèi)孵育作為對照。DRG神經(jīng)元在以上條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在倒置相差顯微鏡下觀察DRG神經(jīng)元活細(xì)胞生長狀態(tài)，用MAP2進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記后測量單個神經(jīng)元突起的長度，用WST-1檢測DRG神經(jīng)元細(xì)胞活力，用Hoechst33342染色法檢測DRG神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，用MAP2和CGRP或NF-200免疫熒光雙標(biāo)記檢測DRG神經(jīng)元表型的變化，用real-t

9、imePCR分析技術(shù)檢測CGRPmRNA和NF-200mRNA的表達(dá)變化，用Westernblot分析技術(shù)檢測CGRP和NF-200蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，PT可影響DRG神經(jīng)元的生長狀態(tài)，使DRG神經(jīng)元突起的長度變短，細(xì)胞活力減低，細(xì)胞凋亡率升高，CGRP-IR神經(jīng)元和NF-200-IR神經(jīng)元表型的比例、CGRP和NF-200蛋白及其mRNA的水平下降;IGF-1可使具有PT毒性的DRG神經(jīng)元的突起延長，細(xì)胞活力增加，細(xì)胞凋亡率降低，I

10、GF-1可挽救PT誘發(fā)的CGRP-IR神經(jīng)元表型的比例下降，但對NF-200-IR神經(jīng)元表型的變化沒有影響;IGF-1對DRG神經(jīng)元生長狀態(tài)的改善和對DRG神經(jīng)元特定表型的影響作用是通過激活ERK1/2和PI3K/Akt細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而實(shí)現(xiàn)的。本研究的結(jié)果表明，IGF-1可通過抑制具有PT毒性的DRG神經(jīng)元凋亡而增加神經(jīng)元細(xì)胞活力和促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長，IGF-1主要是對支配皮膚的DRG神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，PT對DRG神經(jīng)元不同亞群的

11、神經(jīng)毒性作用以及IGF-1對具有PT毒性的特定神經(jīng)元表型神經(jīng)營養(yǎng)作用，為進(jìn)一步研究IGF-1緩解PT誘發(fā)的神經(jīng)毒性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第二部分IGF-1緩解紫杉醇誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的實(shí)驗(yàn)研究
　　由于PT的神經(jīng)毒性可誘發(fā)周圍神經(jīng)病變，這種周圍神經(jīng)病變的神經(jīng)病理性疼痛癥狀用常規(guī)的鎮(zhèn)痛藥物難以緩解。因此，通過神經(jīng)營養(yǎng)的角度改善神經(jīng)元的功能狀態(tài)，是緩解這種周圍神經(jīng)病變所致的神經(jīng)病理性疼痛癥狀的一個具有研究前景和應(yīng)用前景的領(lǐng)域。

12、IGF-1對不同神經(jīng)損傷的改善作用和其特有的神經(jīng)營養(yǎng)作用，以及IGF-1通過激活特有的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的特性，提供了通過干預(yù)新的潛在性治療靶點(diǎn)緩解PT誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的可行性。因此，本研究利用腹膜腔注射（intraperitoneallyinjection，i.p.）PT建立PT誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠動物模型，分別鞘內(nèi)注射IGF-1、ERK1/2抑制劑PD98059+IGF-1、PI3K抑制劑LY294002+IG

13、F-1，檢測各組大鼠觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值的變化和L4～6DRG神經(jīng)元CGRP和NF-200及其mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，PT可使大鼠觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值降低，鞘內(nèi)注射IGF-1可使大鼠觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值升高，并使其提前恢復(fù)至正常水平，預(yù)先鞘內(nèi)注射ERK1/2抑制劑PD98059或PI3K抑制劑LY294002可阻斷IGF-1的效應(yīng)。PT可使大鼠L4～6DRG神經(jīng)元CGRP及其mRNA的表達(dá)上調(diào)，而NF-200及其mRN

14、A的表達(dá)下調(diào)。而鞘內(nèi)注射IGF-1后，DRG神經(jīng)元CGRP及其mRNA的表達(dá)趨于正常，而NF-200及其mRNA的表達(dá)則不受IGF-1的影響。IGF-1所致的DRG神經(jīng)元CGRP及其mRNA的表達(dá)變化效應(yīng)可被預(yù)先鞘內(nèi)注射ERK1/2抑制劑PD98059或PI3K抑制劑LY294002所阻斷。這些結(jié)果表明，IGF-1可通過ERK1/2和PI3K/Akt細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路緩解PT誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛，這可能是由于IGF-1改善了不同亞群的DR