羥基化磁性微粒分離純化糖結(jié)合蛋白方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、研究背景：糖結(jié)合蛋白(glycan binding proteins，GBPs)通過和糖蛋白糖鏈或糖脂糖鏈的相互作用調(diào)控細(xì)胞間的識別、信號傳遞、細(xì)胞的內(nèi)吞和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運輸、細(xì)胞生長、分化以及凋亡、外界病原微生物的感染等一些最基本的也是最主要的生物學(xué)功能。目前，國內(nèi)外對GBPs分離提取主要采取親和層析和離子交換層析相結(jié)合的方法，但是由于此方法非特異性吸附強、費時費力、操作復(fù)雜、目的蛋白需要濃縮等缺點，不利于低豐度蛋白的研究?；贕BPs

2、分離技術(shù)存在的不足，我們發(fā)展了基于磁性微粒分離純化GBPs的新技術(shù)，能高效率、快速、簡便的對GBPs進行分離純化。 目的：建立以功能化磁性微粒為載體共價偶聯(lián)還原糖鏈的方法，利用聯(lián)有糖鏈的功能化磁性微粒對生物學(xué)蛋白樣品進行糖結(jié)合蛋白的分離純化，并對得到的糖結(jié)合蛋白進行蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究。 方法：以功能化磁性微粒為載體共價偶聯(lián)甘露糖、葡萄糖以及纖維二糖，對三種糖的固定化及分離提取糖結(jié)合蛋白的條件進行優(yōu)化。對健康人血清、大骨

3、節(jié)病人血清以及肝癌病人血清中的糖結(jié)合蛋白進行分離提取，并對所得到的蛋白進行雙向電泳，通過2DImageMaster分析軟件對雙向電泳凝膠進行背景消減，蛋白點識別及匹配。比較病人與健康人血清中糖結(jié)合蛋白表達的差異。 結(jié)果：通過還原糖鏈與四種功能化磁性微粒(Fe3O4磁性微粒、環(huán)氧化磁性微粒、肼化磁性微粒以及羥基化磁性微粒)偶聯(lián)的比較，實驗結(jié)果表明羥基化磁性微粒對還原糖鏈偶聯(lián)的能力以及穩(wěn)定性強與其他三種磁性微粒。接著又對磁性微粒羥基

4、化修飾的條件進行了優(yōu)化，確定了最佳化學(xué)修飾時間、4—羥基苯甲酰肼濃度以及反應(yīng)溫度。通過對糖鏈與羥基化磁性微粒最適偶聯(lián)緩沖體系、偶聯(lián)緩沖液的pH、偶聯(lián)溫度條件的優(yōu)化，使糖鏈與羥基化磁性微粒的偶聯(lián)量達到最佳。研究了結(jié)合緩沖體系及洗脫體系對糖磁粒復(fù)合體(聯(lián)有糖鏈的磁性微粒)穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明二者對該復(fù)合體穩(wěn)定性并無顯著的影響。確定1％ SDS作為糖結(jié)合蛋白洗脫緩沖液。利用該方法對健康人血清、大骨節(jié)病人血清以及肝癌病人血清進行了糖結(jié)合蛋白的

5、分離純化，通過SDS—PAGE電泳以及銀染顯色顯示出患者與健康人血清中糖結(jié)合蛋白的異同，又結(jié)合2D電泳技術(shù)及其圖像分析，分別建立了健康人血清和大骨節(jié)病人血清，健康人與肝癌病人血清中糖結(jié)合蛋白的差異圖譜。 結(jié)論：以羥基化磁性微粒為載體可實現(xiàn)各種還原糖的固定化修飾。在相同條件下可對多種還原糖鏈進行有效偶聯(lián)。利用羥基化磁性微粒固定還原糖鏈分離純化復(fù)雜樣本中的糖結(jié)合蛋白，此方法能降低蛋白質(zhì)組份的復(fù)雜性，可應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。結(jié)合雙向電