百脈根小GTPase ROP6激活蛋白GAP的分離和鑒定.pdf

1、豆科植物和根瘤菌共生固氮作用在現(xiàn)代可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中具有重要的意義。共生固氮研究的重點主要集中在豆科植物對根瘤菌結(jié)瘤因子的識別和信號傳遞、根瘤菌侵入線及根瘤形成的分子機制，以揭示豆科植物與根瘤菌共生固氮體系形成的奧秘。本研究在發(fā)現(xiàn)小GTPase ROP6參與調(diào)節(jié)百脈根共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)上，比對百脈根數(shù)據(jù)庫，鑒定出三個與ROP6相關(guān)的激活蛋白GAP蛋白，利用酵母體內(nèi)雙雜交和pulldown技術(shù)證實它們能與ROP6的CA突變體相互作用。主要的

2、研究結(jié)果如下：
　　 ⑴利用已經(jīng)報道的擬南芥等物種的RopGAPs蛋白序列比對百脈根數(shù)據(jù)庫，鑒定到幾個RopGAP蛋白，通過PCR擴增獲得其中三個基因。它們分別是LjRacGAP1，LjRacGAP2，LjRacGAP3。已有的研究表明，這三個基因編碼的蛋白分別具有與另外兩個百脈根小GTPase Rac1和Rac2組成活化突變體相互作用的功能，其中Rac2在根瘤發(fā)育的過程中表達有所增強。
　　 ⑵ROP6有兩個突變體，組

3、成型活化突變體ROP6-CA(constitutively activemutants)和功能缺失突變體ROP6-DN(dominant negative mutants)，利用體外蛋白pull-down和酵母雙雜交體內(nèi)實驗驗證了三個GAP蛋白與ROP6突變體蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)它們都能特異性與ROP6-CA互相作用，而不能與野生型和DN突變的ROP6相互作用。
　　 ⑶ROP6是一個小GTPase，體外GTPase酶活性檢

4、測表明，ROP6具有微弱的GTPase酶活性。在反應(yīng)體系中加入純化的LjRacGAP1蛋白，增強了ROP6的GTPase酶活性，說明GAP蛋白具有激活ROP6的功能。
　　 ⑷Real-Time RT-PCR研究結(jié)果表明，LjRacGAP1，LjRacGAP2，LjRacGAP3三個基因在接種和未接種的根中均有表達。其中LjRacGAP1的表達不受接種根瘤菌的影響;LjRacGAP2在接種根瘤菌2天表達下調(diào)，而后則趨于穩(wěn)定;Lj