豬肉嫩度性狀評(píng)價(jià)體系研究及嫩度相關(guān)新基因的克隆、時(shí)空表達(dá)譜分析.pdf

1、本研究采集18頭六月齡DLY商品豬的背最長(zhǎng)肌樣品，通過24、72、144小時(shí)三種不同時(shí)間嫩化處理得到54份嫩度性狀表現(xiàn)有差異的樣品。利用Warner-Bratzler剪切力測(cè)定、質(zhì)構(gòu)剖面分析(TPA)和感官評(píng)定，分析了各樣品的質(zhì)構(gòu)性狀，并分析了儀器測(cè)定與感官測(cè)定數(shù)據(jù)間的線性關(guān)系。Warner-Bratzler剪切力測(cè)定中得到的最大剪切力、W-B硬度和平均剪切力與感官硬度、彈性、多汁性間均存在顯著或極顯著(P＜0.05或P＜0.01)的相

2、關(guān)性，其中最強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系表現(xiàn)在最大剪切力與感官硬度間(r=0.69385，P＜.0001)；TPA分析數(shù)據(jù)與感官測(cè)定指標(biāo)間的相關(guān)程度較弱，最強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系表現(xiàn)在感官硬度與TPA硬度間(r=0.46075，P=0.0047)。進(jìn)一步采用主成分-逐步回歸法，以儀器測(cè)定指標(biāo)為自變量，感官評(píng)定指標(biāo)為依變量進(jìn)行回歸分析，分別得到具有統(tǒng)計(jì)意義的感官硬度、感官?gòu)椥院投嘀缘念A(yù)測(cè)方程，其中對(duì)感官硬度的預(yù)測(cè)效果較好，方程決定系數(shù)達(dá)到0.6146；而對(duì)感官?gòu)?/p>

3、性和多汁性的預(yù)測(cè)效果較差，方程決定系數(shù)為0.3977和0.4234。 采用RT-PCR結(jié)合克隆測(cè)序的方法，從豬肌肉組織總RNA中克隆出了豬組織蛋白酶B(CTSB)基因的cDNA序列，并推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列。豬CTSB基因開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)1008bp，編碼335個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果表明，豬與人、小家鼠、牛的CTSB基因cDNA編碼區(qū)(CDS)同源性分別為85％、81％、90％，推測(cè)的氨基酸序列同源性分別為81％、7

4、9％、91％。利用同源性結(jié)合序列特征預(yù)測(cè)表明該蛋白具有信號(hào)肽和前肽序列。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模分析表明，該蛋白具有木瓜蛋白酶家族的典型空間結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)底物結(jié)合凹槽和3個(gè)相互靠近的活性位點(diǎn)。利用直接測(cè)序的方法，分別在第六和第七外顯子內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩處未造成編碼氨基酸改變的T-C同義突變位點(diǎn)，另外還采用PCR-SSCP方法，在237頭個(gè)體中分析了CTSB基因第6內(nèi)含子內(nèi)的SSCP位點(diǎn)多態(tài)性，檢測(cè)到3個(gè)等位基因6種基因型。FF基因型個(gè)體的各項(xiàng)嫩度指標(biāo)最

5、高，其最大剪切力與硬度值分別為6.79kg和24.06kg.s，極顯著地高于EE和EF基因型個(gè)體(P＜0.01)，平均剪切力為5.23kg，顯著地高于EF基因型個(gè)體(P＜0.05)。另外發(fā)現(xiàn)CTSB基因的一種轉(zhuǎn)錄變異體CTSB2，在5’非編碼區(qū)內(nèi)比野生型CTSBmRNA多出一段140bp的插入序列，推測(cè)可能是由外顯子可變剪切造成的。Real-TimePCR結(jié)果表明CTSB基因mRNA表達(dá)量受到組織、發(fā)育階段和品種因素影響。表達(dá)量最高的組

6、織為腎臟和肝臟，而在心肌和骨骼肌中低豐度表達(dá)，并且在三處不同部位的骨骼肌間無顯著表達(dá)量差異。CTSB基因mRNA表達(dá)量在0～5月齡長(zhǎng)白豬和梅山豬背最長(zhǎng)肌中表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，梅山豬峰值出現(xiàn)較早，并在4月齡后再次出現(xiàn)急劇上升趨勢(shì)。而在藏豬背最長(zhǎng)肌中則表現(xiàn)出持續(xù)降低的變化趨勢(shì)，且該基因表達(dá)量極顯著地高于其他兩個(gè)品種。 同樣采用RT-PCR結(jié)合克隆測(cè)序的方法，從豬肌肉組織總RNA中克隆出了豬肉嫩度性狀候選基因----半胱氨酸

7、蛋白酶抑制素B(CystatinB，CTSB)基因序列，并推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列。豬CystatinB基因ORF全長(zhǎng)297bp，編碼98個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果表明，豬與人、鼠、牛的CystatinB基因cDNA編碼區(qū)(CDS)同源性分別為81％、85％、89％，推測(cè)的氨基酸序列同源性為83％、76％、85％。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模分析表明，該蛋白與人、鼠CystatinB類似，具有stefin類蛋白酶抑制劑的典型空間結(jié)構(gòu)，包括5條平行的

8、β-sheet和負(fù)責(zé)與被抑制酶結(jié)合的楔形邊緣。另外還采用PCR-RFLP方法，分析了237頭個(gè)體CSTB基因第二內(nèi)含子內(nèi)PvuⅡ酶切位點(diǎn)的多態(tài)性，檢測(cè)到了AA、AB和BB三種基因型，關(guān)聯(lián)性分析表明AA基因型個(gè)體的各項(xiàng)嫩度指標(biāo)均極顯著低于另兩種基因型的個(gè)體(P＜0.01)，最大剪切力為5.76kg、硬度值為20.15kg.s、平均剪切力為3.66kg。Real-TimePCR試驗(yàn)結(jié)果表明CSTB基因mRNA表達(dá)量受到組織、發(fā)育階段和品種因