利用真核表達(dá)體系驗(yàn)證茶樹UGT84A22和C4H基因的功能.pdf

1、多酚類物質(zhì)是茶樹次生代謝的特征成分，同時(shí)也是茶葉有益人體健康的重要組成成分，影響著茶葉色澤、香氣、滋味等感官品質(zhì)的形成。茶樹的多酚類物質(zhì)及其衍生物種類復(fù)雜多樣，其生物合成主要途徑涉及莽草酸途徑，苯丙烷代謝途徑和類黃酮合成途徑，同時(shí)還涉及一些衍生化途徑，如甲基化、?；⑻擒栈土u基化等。本文重點(diǎn)研究酚類物質(zhì)糖苷化和羥基化的相關(guān)基因及其功能，能夠?yàn)樯钊肓私獠铇涠喾宇愇镔|(zhì)代謝調(diào)控提供基礎(chǔ)，對(duì)于開展茶樹新品種選育工作和研究茶葉品質(zhì)形成機(jī)理具有

2、一定的指導(dǎo)意義。
　　本文利用生物信息學(xué)手段對(duì)茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的UGTs基因進(jìn)行篩選、分類和基序分析；利用真核表達(dá)體系對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已克隆全長(zhǎng)的 CsUGT84A22基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。利用RACE技術(shù)和基因組步移技術(shù)分別克隆CsC4H基因全長(zhǎng)及其啟動(dòng)子序列，并利用真核表達(dá)體系驗(yàn)證CsC4H基因功能；利用qRT-PCR技術(shù)分析CsC4H基因在不同發(fā)育組織和器官的表達(dá)特異性；利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察和分

3、析CsC4H帶GFP標(biāo)簽融合蛋白在植物體內(nèi)的亞細(xì)胞定位情況。主要研究結(jié)果如下：
　　1.基于NCBI登陸的5個(gè)茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（PRJNA167330、PRJNA223181、PRJNA51793、PRJNA170701、PRJNA261465）以及本實(shí)驗(yàn)室通過高通量測(cè)序獲得的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合基因功能注釋、PSPG box的44個(gè)保守氨基酸序列以及同源序列檢索等手段，共篩選得到178條CsUGTs基因，其中129條具有C末端保

4、守區(qū)。
　　2.利用MEGA6.0軟件對(duì)132條氨基酸序列長(zhǎng)度在250~522之間的CsUGTs構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示：茶樹中的UGTs可以被劃分為16個(gè)系統(tǒng)發(fā)育組（A-M、O、P、R）。較擬南芥和其他植物不同的是，茶樹中沒有發(fā)現(xiàn)N組和Q組，但是可以劃分出一個(gè)新的R組。利用Weblogo軟件對(duì)各系統(tǒng)發(fā)育組的茶樹UGTs與其他植物UGTs進(jìn)行基序分析，得到PSPG box序列上保守氨基酸殘基出現(xiàn)相對(duì)頻率的分布圖。
　　3.在

5、茶樹UGT進(jìn)化樹分析的結(jié)果上，本實(shí)驗(yàn)選擇CsUGT84A22基因進(jìn)行真核表達(dá)。將構(gòu)建成功的pYES-CsUGT84A22重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至真核表達(dá)菌株釀酒酵母WAT11。對(duì)半乳糖誘導(dǎo)后的酵母細(xì)胞充分破碎，高速離心取上清液進(jìn)行酶活反應(yīng)。HPLC技術(shù)檢測(cè)酶產(chǎn)物的結(jié)果表明：CsUGT84A22重組蛋白具有以UDP-葡萄糖為糖供體催化酚酸形成糖酯的活性。
　　4.在茶樹肉桂酸4-羥基化酶基因EST序列基礎(chǔ)上，通過RACE技術(shù)克隆了CsC4H基

6、因的全長(zhǎng)序列，其中開放閱讀框長(zhǎng)度為1518 bp，編碼505個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量為58.15 kD，理論等電點(diǎn)為9.29。利用基因組步移技術(shù)克隆得到CsC4H起始密碼子上游1840 bp的啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子區(qū)域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本轉(zhuǎn)錄元件外，還存在多個(gè)誘導(dǎo)型和組織特異型的順式作用元件。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明：CsC4H基因在芽、葉、莖、根中都有表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明：CsC4H