釀酒酵母AFR1過量表達與MPK1及MIH1缺失導(dǎo)致的合成致死.pdf

1、釀酒酵母五條MAP激酶信號通路間存在重要的交互作用。AFR1p對信息素信號通路和細(xì)胞壁完整性信號通路都具有調(diào)節(jié)作用，而且AFR1p也能影響細(xì)胞形態(tài)檢驗點。對其作用機制的研究有助于解決相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。本實驗主要研究Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株和Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株合成致死現(xiàn)象及合成致死機理。
　　 本研究構(gòu)建了pUC18-RYu-E-Gal1p-Afr1p-Afr1質(zhì)粒并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母W303-A菌株

2、，通過同源重組將Gal1強啟動子整合于酵母染色體AFR1基因位點上游，得到Gal1p-AFR1菌株。接著將Gal1p-AFR1菌株分別與mpk1Δ菌株和mih1Δ菌株交配并通過四分體拆分得到Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株和Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株。通過對菌株形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，半乳糖誘導(dǎo)AFR1過量表達時，缺失MIH1基因會使芽的極化程度進一步加強。采用稀釋涂板的方法研究Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株與Gal1p-A

3、FR1-mih1Δ菌株的合成致死表型。Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株在YPGal平板無菌落長出，說明缺失MPK1與過量表達AFR1表現(xiàn)為合成致死，而且這種合成致死不能用低溫彌補。Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株在YPGal+1 M sorbitol平板上無菌落長出。說明過量表達AFR1與缺失MIH1在1M sorbitol存在下表現(xiàn)為合成致死。
　　 通過研究致死菌株細(xì)胞壁的變化來探索其致死機理，測量了Gal1p-AF

4、R1-mpk1Δ菌株和Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株對蝸牛酶的敏感性。結(jié)果表明Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株與mpk1Δ菌株類似，都對蝸牛酶較敏感，但在致死條件下卻表現(xiàn)為敏感性的降低，說明其合成致死與細(xì)胞壁成分變化沒有必然聯(lián)系。Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株在致死條件下，細(xì)胞壁對蝸牛酶也沒有強的敏感性。說明其有著復(fù)雜的致死機理。本研究還發(fā)現(xiàn)，以半乳糖為碳源或是加入滲透壓支持劑，正常情況下都會使酵母細(xì)胞壁對蝸牛酶的抗性增