ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵生產(chǎn)的研究.pdf

1、ε-聚賴氨酸(ε-PL)是一種含有25-30個(gè)賴氨酸殘基的同型單體聚合物多肽，由賴氨酸殘基通過α-羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接而成，是一種具有抑菌功效的多肽。ε-PL抑菌譜廣，在酸性和微酸性環(huán)境中對(duì)革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果．此外，ε-PL安全性高，能在人體內(nèi)分解為賴氨酸，是一種營養(yǎng)型抑菌劑。ε-PL已于2003年10月被FDA批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮．但是，目前ε-PL采用的是微生物

2、發(fā)酵生產(chǎn)方法，產(chǎn)量低，造成生產(chǎn)成本提高、價(jià)格昂貴，很大程度上限制了ε-PL的工業(yè)化生產(chǎn)和推廣使用．
　　 本論文旨在篩選出ε-PL高產(chǎn)菌株，通過培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化、誘變選育等方法提高ε-PL的產(chǎn)量，確定發(fā)酵液中分離提純?chǔ)?PL及小試生產(chǎn)的工藝條件，同時(shí)探討ε-PL細(xì)胞外合成的方法．
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)優(yōu)化了從土壤中分離放線菌的方法及分離程序，并建立了一種靈敏的ε-PL產(chǎn)生菌高通量篩選方法，結(jié)

3、果表明，土樣經(jīng)CaCO3處理后，過100目篩，取59土樣50℃烘1h，加入50 mL5 mM磷酸緩沖液(pH7.0，蛋白胨6％和SDS0.05％)．50℃，150rpm振蕩培養(yǎng)1Omin;稀釋適當(dāng)濃度后，涂布于含有0.005％K2Cr2O7的篩選培養(yǎng)基上，明顯抑制了細(xì)菌的生長，有利于放線菌的分離．同時(shí)，通過在培養(yǎng)基中添加0.002％亞甲基藍(lán)，初步篩選到了176株產(chǎn)堿菌株；利用Dragendorff試劑檢測(cè)得到49株產(chǎn)堿菌株；復(fù)篩得到7株

4、ε-PL產(chǎn)量較高的ε-PL產(chǎn)生菌，其中菌株157的產(chǎn)量最高，為0.201g/L。
　　 通過對(duì)菌株157進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征等初步鑒定后，確定為鏈霉菌屬，采用Sherlock全自動(dòng)微生物鑒定和分子生物學(xué)鑒定，對(duì)其16SrDNA全系列的相似性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，菌株157與鏈霉菌屬內(nèi)的婁徹氏鏈霉菌（S.rochei）同源性最高為100％，但與鏈霉菌屬內(nèi)多個(gè)種同源性均在97％以上，不能準(zhǔn)確鑒定到種，因此，鑒

5、定結(jié)論為鏈霉菌屬，將其標(biāo)記為S.sp.157。
　　 (2)對(duì)菌株S.sp.157進(jìn)行了培養(yǎng)基成分碳源、氮源的篩選，結(jié)果表明，葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4分別為最佳碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源。單獨(dú)使用有機(jī)氮源或無機(jī)氮源均不能產(chǎn)生ε-PL，(NH4)2SO4和蛋白胨共同使用，才有利于ε-PL的積累。
　　 通過采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用響應(yīng)面分析方法，對(duì)影響發(fā)酵產(chǎn)量的三個(gè)主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了最佳

6、培養(yǎng)基的組成為(g/L)：葡萄糖，62.49;蛋白胨，5.71;(NH4)2SO4,11.19; MgSO4,0.5; FeSO4,0.03; ZnSO4,0.04;KH2PO4，1.36; Na2HPO4.12H2O，3.58，pH6.8．使用此培養(yǎng)基，ε-PL產(chǎn)量為0.349±0.025 mg/mL，比初始培養(yǎng)基提高了1.75倍．
　　 運(yùn)用單因素試驗(yàn)方法研究了無機(jī)鹽對(duì)菌株ε-PL產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，MgSO4的最佳濃度為

7、0.1％，而FeSO4、ZnSO4對(duì)ε-PL產(chǎn)量的影響不明顯。
　　 研究了發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)菌株ε-PL發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)條件為：裝液量100 mL/500 mL三角瓶，初始pH7.0，接種量3％，發(fā)酵溫度30℃。
　　 (3)研究了菌株誘變后定向篩選出正向突變株的條件，即選用AEC和甘氨酸作為抗性篩選劑進(jìn)行定向篩選，菌株S.sp.157、S.albulus的誘變篩選抗性臨界濃度( AECr+Glyr)分別為7

8、 mg/mL+6 mg/mL、9 mg/mL+6 mg/mL。
　　 分別采用紫外線誘變、DES化學(xué)誘變、60Coγ射線輻照誘變、常壓室溫等離子體( ARTP)誘變等多種方法對(duì)菌株S.sp.157、S.albulus進(jìn)行高產(chǎn)菌株誘變選育。結(jié)果表明，紫外線誘交、DES化學(xué)誘變、ARTP誘交后均得到了較高ε-PL產(chǎn)量的誘變菌株，其中有4株變異株的ε-PL產(chǎn)量明顯提高，分別為S.sp.157 UV1、S.albulus UV5、S.a

9、lbulus A29、S.albulus A30，進(jìn)行五次傳代培養(yǎng)后，ε-PL的產(chǎn)率均沒有出現(xiàn)波動(dòng)，分別是出發(fā)菌株的2.3、2.9、3.8、3.6倍，遺傳穩(wěn)定性良好。而60Coγ射線輻照誘變的效果不理想，該方法不適用于菌株S.sp.157、S.albulus的誘變選育。
　　 (4)在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，對(duì)突變株S.albulus A29進(jìn)行上罐發(fā)酵，采用5L發(fā)酵罐，進(jìn)行了ε-PL小試生產(chǎn)的研究．結(jié)果表明，要提高ε-PL的產(chǎn)量，必

10、須采取合適的策略，即：在第一階段，充分創(chuàng)造生長條件（如補(bǔ)料），使菌體量達(dá)到最高，為后續(xù)ε-PL的合成奠定基礎(chǔ)；在第二階段，延長ε-PL生成的時(shí)間，同時(shí)保持菌種能夠持續(xù)生長（如調(diào)控pH）。
　　 采用pH調(diào)控及補(bǔ)料的策略對(duì)發(fā)酵進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH調(diào)控及適時(shí)補(bǔ)料(甘油：(NH4)2SO4=5:1），使菌種在發(fā)酵過程中菌體生長期延長，ε-PL產(chǎn)量持續(xù)增加，ε-PL產(chǎn)量為8.92 g/L，是未調(diào)控的發(fā)酵體系的5.8倍。
　

11、　 (5)確立了從發(fā)酵液中分離提純?chǔ)?PL的工藝。
　　 發(fā)酵液經(jīng)過離心分離、等電點(diǎn)沉淀蛋白（調(diào)pH7.0）、超濾（5K聚砜超濾膜）之后，達(dá)到了去除發(fā)酵液中不溶性固形物及部分雜蛋白的效果。
　　 采用三種不同的樹脂分別進(jìn)行離子交換吸附，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弱酸型陽離子交換樹脂HD-2對(duì)ε-PL的吸附及解吸效果最好，當(dāng)層析柱為22mm×300mm時(shí)，吸附及解吸條件為：上樣流速為3mL/min，洗脫劑為O.1mol/L的HCl，

12、洗脫流速為3mL/min，此分離提純工藝條件下ε-PL的回收率為92.0％．
　　 將通過弱酸型陽離子交換樹脂HD-2的解吸液進(jìn)行脫色，濃縮后，真空冷凍干燥，得到粗品，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳及高效液相檢測(cè)后，可確定為ε-PL粗品。
　　 (6)確立了HPLC法檢測(cè)ε-PL的方法；初步探討了ε-PL細(xì)胞外合成的反應(yīng)體系，結(jié)果表明，菌體細(xì)胞經(jīng)過超聲波破碎后，高速離心后獲得細(xì)胞粗酶液，以粗酶液，L-1ysine