ε-聚賴氨酸的菌種選育及合成過程強(qiáng)化.pdf

1、ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)由25-35個(gè)L-賴氨酸單體通過α-COOH和ε-NH2脫水縮合的酰胺鍵聚合而成。它具有水溶性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好、抑菌譜廣、無毒可食用等化學(xué)防腐劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn),因此是一種安全高效的天然生物防腐劑。另外,由于ε-PL支鏈帶有正電荷的α-NH2,它還能用作生物可降解材料、乳化劑、高吸收性水凝膠、藥物載體、抗癌增進(jìn)劑和生物芯片外被等,所以有著廣闊的發(fā)展前景。本論文主要對(duì)以下幾個(gè)部分進(jìn)行了研

2、究:
　　 對(duì)已有的ε-PL產(chǎn)生菌的篩選方法進(jìn)行了改進(jìn)。首次報(bào)道了一種對(duì)菌體毒性遠(yuǎn)小于美藍(lán)的染色劑-誘惑紅,直接添加到初篩培養(yǎng)基平板中,完全不影響菌體的生長(zhǎng)。誘惑紅作為一種陰離子型染料能與帶正電荷的ε-PL發(fā)生靜電吸引而形成濃縮的顏色圈,從而簡(jiǎn)化了篩菌步驟,可以快速、方便的篩選出目的菌。利用該方法,成功地從土壤中篩選得到了26株ε-PL產(chǎn)生菌,產(chǎn)量為0.15-0.50 g/L;通過薄板層析,進(jìn)一步確定了菌株的產(chǎn)物是賴氨酸聚合物。

3、
　　 探索了對(duì)禾粟鏈霉菌(Streptomyces graminearus)進(jìn)行原生質(zhì)體融合育種的方法。首先對(duì)禾粟鏈霉菌原生質(zhì)體制備與融合的主要因素進(jìn)行了研究,最佳條件為:0.5％(W/V)溶菌酶作為破壁酶,30℃酶解120 min,得到原生質(zhì)體后采用30％(W/V)的PEG6000促融5 min。以磺胺胍抗性為指標(biāo),篩選紫外誘變后的禾粟鏈霉菌作為融合親本,按上述條件進(jìn)行原生質(zhì)體融合,得到了最高產(chǎn)量為0.91 g/L的融合子,

4、較初始菌株的產(chǎn)量提高了72％。
　　 考察了不同氨基酸對(duì)禾粟鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的影響。發(fā)現(xiàn)在添加濃度為1 mM時(shí),苯丙氨酸(Phe)對(duì)ε-PL發(fā)酵的促進(jìn)作用最明顯,進(jìn)一步對(duì)Phe的添加濃度和添加時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,在發(fā)酵初始添加3 mM Phe使ε-PL產(chǎn)量提高了20-30％。首次建立了禾粟鏈霉菌以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL,的中心代謝網(wǎng)絡(luò),并通過代謝流量分析(MFA)闡述了Phe促進(jìn)ε-PL產(chǎn)量提高的內(nèi)在機(jī)理,即添加Phe抑