PRGD-FDLLA-β-TCP-NGF復(fù)合材料及基因修飾干細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)的研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)尤其是中樞神經(jīng)的修復(fù),一直是研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。本研究分別從周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)修復(fù)著手,探討合適的誘導(dǎo)修復(fù)神經(jīng)損傷的生物材料和修復(fù)手段,為最終應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。
　　 本論文按仿生原理設(shè)計(jì)合成的新型誘導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)材料RGD多肽接枝聚(乳酸-羥基乙酸-L-賴氨酸)／聚乳酸／β-磷酸三鈣／神經(jīng)生長因子(PRGD／PDLLA／β-TCP／NGF,簡稱PRTN),并對其進(jìn)行了成分和性能表征。對PRTN復(fù)合材料進(jìn)行體外評價(jià):通

2、過測量PRTN體外12周的質(zhì)量損耗和降解液的pH值,確定材料具有很好的降解性；通過酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測PRTN復(fù)合材料中神經(jīng)生長因子(NGF)的釋放,表明隨著材料的降解,NGF逐步釋放,第30天仍可檢測到,與PC12細(xì)胞作用表明第30天釋放的NGF仍具有活性。將PRTN與原代提取的雪旺細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng),以傳統(tǒng)材料外消旋聚乳酸(PDLLA)作對照,通過四唑鹽(MTT)比色法測試細(xì)胞的生長、增殖情況,并用掃描電鏡觀察PRTN表面細(xì)胞生長

3、的形態(tài),結(jié)果表明雪旺細(xì)胞在PRTN表面的生長、增殖情況優(yōu)于PDLLA,具有良好的細(xì)胞相容性。
　　 將PRTN復(fù)合材料制備成神經(jīng)導(dǎo)管,移植入10mm神經(jīng)缺損的大鼠,分別于術(shù)后3、6個(gè)月觀測受損神經(jīng)的修復(fù)效果。大體觀察,術(shù)后3個(gè)月時(shí)大鼠活動(dòng)情況得到恢復(fù),術(shù)側(cè)肢體能直立,6個(gè)月時(shí)活動(dòng)自如；電生理檢測神經(jīng)傳導(dǎo)速度得到3個(gè)月PRTN傳導(dǎo)速度大于對照PDLLA組,6個(gè)月時(shí)與自體神經(jīng)移植組相當(dāng)；3個(gè)月取材可見再生神經(jīng)已經(jīng)成功橋接遠(yuǎn)近斷端,6

4、個(gè)月神經(jīng)變粗；取再生的中段神經(jīng)HE染色觀察材料逐步降解,再生神經(jīng)直徑變粗,血管分布更豐富；亞甲藍(lán)染色觀察再生神經(jīng)髓鞘厚度3個(gè)月時(shí)PRTN組優(yōu)于PDLLA組,6個(gè)月時(shí)髓鞘變厚,大小及分布更均勻,接近自體神經(jīng)移植組；通過透射電鏡觀察再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu),圖像分析數(shù)據(jù)顯示3個(gè)月時(shí)PPRTN材料組髓鞘板層結(jié)構(gòu)和分布與自體移植組相當(dāng),6個(gè)月時(shí)板層結(jié)構(gòu)更加致密和成熟,與正常神經(jīng)接近。
　　 經(jīng)體內(nèi)移植修復(fù)神經(jīng)缺損,在三頭肌濕重恢復(fù)率、神經(jīng)傳導(dǎo)

5、速度、髓鞘厚度等一系列指標(biāo)上均優(yōu)于PDLLA,術(shù)后6個(gè)月修復(fù)效果與自體神經(jīng)移植組無顯著性差異,髓鞘板層結(jié)構(gòu)與正常神經(jīng)接近。
　　 為了進(jìn)一步探討PRTN復(fù)合材料的應(yīng)用和對干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的影響,提取了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells,hBMMSC),分析了hBMMSC在材料表面生長、增殖情況和周期變化。并將hBMMSC與材料作用前后進(jìn)行干細(xì)胞克隆形成分析和成脂、成神經(jīng)誘導(dǎo)

6、分析。結(jié)果表明hBMMSC在PRTN復(fù)合材料表面生長增殖情況良好,材料對hBMMSC細(xì)胞周期無影響。PRTN復(fù)合材料能獲得干細(xì)胞的數(shù)量較對照組多,且能誘導(dǎo)hBMMSC向脂肪細(xì)胞分化減少,向神經(jīng)細(xì)胞方向分化增加。
　　 在中樞神經(jīng)研究方面,通過體外構(gòu)建慢病毒載體,將BMMSC向神經(jīng)樣細(xì)胞(Neuro-likecell,NLs)誘導(dǎo)分化并經(jīng)GDNF基因修飾,通過熒光顯微鏡采像計(jì)數(shù),NLs-BMMSC基因轉(zhuǎn)染率高達(dá)78％,ELISA實(shí)

7、驗(yàn)表明GDNF過表達(dá)。GDNF轉(zhuǎn)染的NLs-BMMSCs經(jīng)尾靜脈注射移植入骨髓清空的小鼠,4周之后經(jīng)MPTP腹腔注射構(gòu)建帕金森病模型。經(jīng)GDNF轉(zhuǎn)染的NLs-BMMSCs移植后,治療組的帕金森老鼠在行為上較對照組有所改善,取食實(shí)驗(yàn)較對照組多；小鼠中腦黑質(zhì)取材并行免疫組化染色,分析表明GDNF治療組PD小鼠TH陽性細(xì)胞數(shù)量較對照組多,經(jīng)移植的細(xì)胞更多地遷入并集中于受損神經(jīng)細(xì)胞所在部位。初步試驗(yàn)表明經(jīng)骨髓移植的NLs-BMMSCs具有向PD