深海適冷蛋白酶MCP-01對膠原蛋白的催化機制及其在肉類嫩化中的應用基礎研究.pdf

1、深海有機氮的降解是海洋生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。在海洋中，生物合成的高分子量有機氮(High-Molecular-Weight Organic Nitrogen，HMWON)以顆粒有機氮(particulate organic nitrogen，PON)的形式，從海水表層，沉降到深海沉積物中。PON在微生物的作用下降解為高分子量的溶解有機氮(dissolved organicnitrogen，DON)，DON再經(jīng)過微生物的分解、氨化、硝

2、化和反硝化作用，最終完成整個氮循環(huán)。因此，深海沉積物中PON的降解在沉積物整個氮循環(huán)過程中具有非常關鍵的作用。深海沉積物中PON的主要成分是難以被降解的氨基化合物，如膠原蛋白和彈性蛋白等。膠原蛋白由于其特殊的三螺旋結構和復雜的聚合形式，其穩(wěn)定性非常高，很難被除膠原蛋白酶以外的其他蛋白酶降解。目前，研究最多的膠原蛋白酶為哺乳動物的基質(zhì)金屬蛋白酶。細菌中膠原蛋白酶的報道則較少，且多來自陸地致病菌。由于對海洋膠原蛋白酶缺乏研究，因此海洋中膠原

3、蛋白是如何被降解的還不清楚。研究深海膠原蛋白酶的作用機制對于最終闡明深海沉積物中氮的循環(huán)機制和開發(fā)新型蛋白酶具有重要的意義。
　　 適冷蛋白酶MCP-01是分離自深海沉積物中的適冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913分泌的主要蛋白酶。蛋白酶MCP-01前體由835個氨基酸殘基組成，該酶屬于絲氨酸蛋白酶S8家族subtilisin亞家族。Subtilisin中的蛋白酶成熟后絕大多數(shù)只含有一個催化結構域，但MCP

4、-01的成熟酶包括催化結構域、連接區(qū)域、P結構域和PKD結構域四部分，是一個多結構域的subtilisin，此類型蛋白酶被我們命名為Deseasin。本論文以蛋白酶MCP-01對膠原蛋白的降解作用為研究對象，對MCP-01的生化性質(zhì)、分子結構、催化機制及其應用基礎進行了研究，取得了如下研究結果。
　　 1.MCP-01及其各結構域的異源表達體系的建立和分離純化
　　 MCP-01是一個典型的適冷蛋白酶，由于其具有多個結構

5、域，熱穩(wěn)定性較差，在中高溫條件下容易發(fā)生自溶現(xiàn)象，常規(guī)的異源表達方法很難得到有活性的酶。建立適合MCP-01異源表達的條件對進一步研究酶的結構與功能顯得尤為重要。我們的研究發(fā)現(xiàn)，MCP-01在大腸桿菌中的重組表達量較低。在成熟前MCP-01以不具有活性的酶原形式存在于重組菌內(nèi)。在50％海水LB培養(yǎng)基中經(jīng)15℃，200rpm誘導8天后MCP-01能夠分泌到重組菌胞外，并具有活性，但表達分泌量較低，為19.6U/ml。探索并優(yōu)化了MCP-0

6、1催化結構域CD和C端PKD結構域在大腸桿菌中的表達和分離純化條件。最終確定重組蛋白CD的最佳產(chǎn)酶條件為：在50％海水LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)重組菌至OD600=2.0時添加0.05 mM IPTG，在15℃，200 rpm下誘導7天。從發(fā)酵液中利用陰離子交換層析和凝膠過濾層析分離純化有活性的CD重組蛋白，產(chǎn)量為64.8 U/ml。PKD的最佳誘導條件為：在LB培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)重組菌至OD600=1.2，添加0.5 mM IPTG，

7、在15℃，200 rpm下誘導48 h。由于誘導表達的PKD存在于重組菌的胞內(nèi)，利用超聲波破碎和谷胱甘肽融合蛋白親和層析法分離純化含GST標簽的PKD重組蛋白，再經(jīng)凝血酶切割和谷胱甘肽親和層析得到電泳純的PKD。質(zhì)譜分析表明，純化后的CD和PKD重組蛋白的分子量與根據(jù)序列推算的分子量一致。以上結果為進一步研究酶的催化性質(zhì)和機制奠定了基礎。
　　 2.MCP-01催化膠原蛋白降解的底物特異性和酶學性質(zhì)
　　 通過分析蛋白酶

8、MCP-01對各種蛋白和合成肽類的降解效率，并與梭菌產(chǎn)的膠原蛋白酶的底物特異性進行比較，我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶MCP-01能降解多種類型的膠原蛋白，特別是對海洋動物來源的膠原蛋白具有很強的降解能力。除了對不溶的Ⅰ型膠原蛋白有很強的降解效率之外，MCP-01對于多種可溶性膠原蛋白都能降解，降解效率為明膠>酸溶Ⅰ型膠原蛋白>Ⅳ型膠原蛋白>Ⅱ型膠原蛋白。為了分析MCP-01對膠原蛋白的降解機制，用蛋白酶MCP-01酶解牛Ⅰ型膠原蛋白，電泳分離酶解片段

9、，通過N端測序分析了MCP-01在Ⅰ型膠原蛋白上的酶切位點。結果表明，MCP-01在牛Ⅰ型膠原蛋白上有多個特異性切點，這是首次闡明了一個細菌絲氨酸類膠原蛋白酶在膠原蛋白上的切點。其對膠原蛋白的降解方式與動物來源的典型膠原蛋白酶-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在膠原蛋白上的酶切方式完全不同。以不溶的Ⅰ型膠原蛋白為底物，我們研究了MCP-01的各種酶學性質(zhì)。MCP-01在0℃下仍具有12.4％的膠原酶活，是目前唯一報道的適冷膠原蛋白酶。MCP-0

10、1在pH9.0的Tris-HCl緩沖液中的活性最高，在pH6.0-10.0緩沖體系中能保持60％以上的活性。Ca2+能夠顯著增強MCP-01的活力，而Zn2+、Ni2+、Cu2+和Fe2+顯著抑制MCP-01酶活。
　　 3.MCP-01的C端PKD結構域?qū)δz原蛋白的結合能力和膨脹機制
　　 MCP-01的C端具有一個功能未知的PKD結構域。PKD結構域約由80-90個氨基酸殘基組成，最早在人體多囊性腎病致病蛋白中發(fā)現(xiàn)，

11、隨后陸續(xù)在一些微生物的幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和少數(shù)蛋白酶中發(fā)現(xiàn)。目前，其結構已被結晶和解析，結果發(fā)現(xiàn)，盡管一級序列差異較大，但所有PKD都具有類似于抗體的β折疊結構。到目前為止，PKD結構域在蛋白酶中的功能一直沒有得到闡明。
　　 我們研究發(fā)現(xiàn)，缺失PKD結構域的MCP-01的CD能夠降解不溶的Ⅰ型膠原蛋白，但效率只有MCP-01全酶的60％左右。而用重組的PKD結構域預先處理膠原蛋白，可以明顯提高MCP-01的CD對膠原蛋白的降解

12、效率。這些結果表明MCP-01中的PKD結構域在酶催化膠原蛋白降解的過程中可能發(fā)揮重要作用。在大腸桿菌中將PKD結構域基因與綠色熒光蛋白基因融合表達和分離純化，獲得了電泳純的融合蛋白PKD-EGFP。通過測定溶液中PKD-EGFP與膠原蛋白作用前后的熒光值，分析了PKD-EGFP與膠原蛋白的結合能力，結果表明PKD結構域?qū)Σ豢扇苣z原蛋白具有很強的結合能力。為了分析PKD結構域中起作用的關鍵位點，首先通過序列比對分析了MCP-01的PKD

13、結構域中的保守氨基酸殘基，然后構建和表達了這些氨基酸殘基的點突變體，并分析了突變體對膠原蛋白的結合能力。結果表明，PKD結構域中36位的色氨酸殘基的突變使PKD結構域?qū)δz原蛋白的結合能力幾乎完全喪失。而且利用圓二色譜對突變體的結構分析表明，36位的色氨酸的突變沒有對PKD結構域的結構產(chǎn)生影響。這些結果表明，36位的色氨酸殘基是PKD結構域結合膠原蛋白過程中起關鍵作用的位點。
　　 進一步研究發(fā)現(xiàn)，PKD結構域能夠?qū)е履z原蛋白的膨

14、脹，并且膨脹作用具有溫度依賴性。通過SEM觀察到PKD處理后的膠原蛋白直徑由5.3μm增加到8.8μm。通過AFM觀察到PKD結構域能夠與膠原蛋白結合，導致膠原纖絲內(nèi)部發(fā)生解離和松散。Zeta電位結果表明，膠原蛋白表面帶有正凈電荷，經(jīng)PKD處理后，膠原蛋白表面的正凈電荷增多，說明PKD結構域處理后能夠?qū)е履z原蛋白聚合體的解離。圓二色譜研究發(fā)現(xiàn)PKD結構域的結合不會導致膠原三螺旋結構發(fā)生變化，也沒有對膠原三螺旋的熱穩(wěn)定性造成影響。由此，我

15、們提出了MCP-01對膠原蛋白降解的作用機制模型圖，與已報道的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP對膠原蛋白的降解機制不同。
　　 4.MCP-01催化結構域的晶體結構及其對膠原蛋白的催化機制
　　 目前對哺乳動物基質(zhì)金屬蛋白酶MMP的膠原蛋白催化機制研究較為詳細。MMP的催化腔較小，約有5 A左右，難以容納長度為3，000 A，直徑為15 A的膠原蛋白纖維。MMP的Hxp結構域能夠與三螺旋膠原蛋白結合，行使解旋酶作用，局部打開膠原蛋白

16、螺旋，使膠原蛋白結構松散并露出單鏈，從而進入MMP催化腔。但目前對細菌膠原酶對膠原蛋白的催化機制研究很少。
　　 蛋白酶MCP-01與MMP不同，其催化結構域CD能夠單獨降解不可溶膠原蛋白底物，表明其催化腔可能能容納膠原蛋白三螺旋分子。但這并不是subtilisin家族蛋白酶的共同特征。該家族的模式蛋白酶Carlsberg以及其他許多酶都不具有降解膠原蛋白的功能。為了研究蛋白酶MCP-01催化降解膠原蛋白的機制，我們首先對蛋白酶

17、MCP-01的CD進行了結晶，通過X-射線衍射得到了CD的分子結構，分辨率為1.76 A，這是首次報道了一個絲氨酸家族膠原蛋白酶的晶體結構。對CD的結構分析表明，CD具有與Carlsberg相同的拓撲結構和催化三聯(lián)體，但卻具有更大的催化腔，約17 A。通過分子模擬，我們發(fā)現(xiàn)CD催化腔可以容納直徑為15 A的膠原蛋白三螺旋分子。由于催化腔較大，底物進入CD時不需要發(fā)生構象變化。與之相比，Carlsberg的催化腔則較小，約13 A。通過分

18、析CD和膠原蛋白肽的復合物中CD催化腔和膠原蛋白肽的相互作用發(fā)現(xiàn)，催化腔外側的3個loop與酶的底物特異性有關，直接參與了酶對底物的捕獲。比較CD和Carlsberg的催化腔外側loop區(qū)發(fā)現(xiàn)，二者在這些loop區(qū)的氨基酸性質(zhì)及其側鏈長度不同。CD的loop中含有較多的酸性氨基酸和芳香族氨基酸。比較CD與已報道的其它S8家族絲氨酸膠原蛋白酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在這些膠原蛋白酶中也具有較保守的酸性氨基酸和芳香族氨基酸。因此，它們可能是CD與

19、膠原蛋白相互作用的關鍵殘基。我們對這些氨基酸殘基進行了定點突變，并測定了突變體的膠原酶活和酪蛋白酶活，發(fā)現(xiàn)D140、D202、P210、P256、F177和E102等氨基酸殘基突變后，CD的膠原酶活力下降，因此這些殘基可能直接參與了CD與膠原蛋白的相互結合。這些研究結果初步闡明了CD降解膠原蛋白的分子基礎，并為闡明絲氨酸蛋白酶的功能進化研究奠定了基礎。
　　 以上這些研究結果初步揭示了MCP-01對膠原蛋白的降解特性及機制。以M

20、CP-01為代表，Deseasin類蛋白酶可能在深海沉積物中廣泛存在并在深海PON的降解中發(fā)揮作用。我們的研究為進一步闡明包括deseasin在內(nèi)的深海蛋白酶在深海沉積物HMWON的降解中發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)，并為開發(fā)具有新用途的蛋白酶奠定了理論基礎。
　　 5.適冷蛋白酶MCP-01的肉類嫩化作用和嫩化機制
　　 膠原蛋白是肌肉結締組織的重要組成部分，約占80％，是影響肉質(zhì)嫩度的重要因素之一。MCP-01是目前唯一

21、報道的適冷膠原蛋白酶。由于其在低溫及室溫下具有很高的膠原蛋白活性，因此可能在低溫及室溫下具有很好的肉類嫩化能力。為此，以牛肉為樣品，我們研究了蛋白酶MCP-01對肉制品的嫩化能力和嫩化機制，并與目前商品化的嫩化酶木瓜蛋白酶Papain和菠蘿蛋白酶Bromelain進行了比較。研究結果表明，在4℃下，經(jīng)MCP-01處理的牛肉的剪切力的下降幅度與經(jīng)菠蘿蛋白酶處理后的基本相同，表明MCP-01可能具有與菠蘿蛋白酶相似的肉類嫩化能力。MCP-0

22、1嫩化后的牛肉能保持新鮮色澤，具有較高的保水性，形狀基本不變，而木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶嫩化后的牛肉失水率高，形狀發(fā)生皺縮，顏色變暗。底物特異性研究表明，在4℃下，MCP-01降解膠原蛋白的能力明顯高于Bromelain和Papain，表明MCP-01在嫩化過程中能高效降解結締組織中的膠原蛋白。MCP-01與商品化的嫩化酶對牛肉肌細胞中的肌原纖維蛋白的選擇性降解能力不同。Bromelain和Papain能夠毫無選擇性地將牛肉的肌球蛋白重鏈