ARO9、ARO10基因過量表達(dá)對(duì)Saccharomyces cerevisiae產(chǎn)3-甲硫基丙醇代謝調(diào)控的影響.pdf

1、3-甲硫基丙醇是我國芝麻香型白酒的特征性香物質(zhì)，也是多種食品的重要香氣組分，天然存在于葡萄酒、啤酒、醬油、奶酪、番茄和土豆中。3-甲硫基丙醇的香氣閾值低，在食品中建議用量為0.1-10mg/kg，其風(fēng)味依次呈現(xiàn)麥芽香味、香油味和熟土豆味。本文擬通過構(gòu)建釀酒酵母菌株代謝網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行代謝通量分析預(yù)測(cè)目標(biāo)基因，采用基因工程手段改造菌種并進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，為獲得高產(chǎn)3-甲硫基丙醇的基因工程菌株奠定基礎(chǔ)。通過研究，主要得到以下結(jié)果：
　　1.在營(yíng)

2、養(yǎng)缺陷型釀酒酵母INVSc1中，過量表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.58)基因ARO9，分析發(fā)酵液中3-甲硫基丙醇的產(chǎn)量是否提高來驗(yàn)證克隆基因的功能。將ARO9基因與穿梭質(zhì)粒pYES2連接，構(gòu)建釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒pYES2-ARO9，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，使用醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株INVSc1中進(jìn)行表達(dá)，驗(yàn)證ARO9基因過量表達(dá)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物3-甲硫基丙醇影響。結(jié)果表明，構(gòu)建的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子SC09-1發(fā)酵120h時(shí)，其生成量比未導(dǎo)入的對(duì)照菌株，其3

3、-甲硫基丙醇產(chǎn)量提高16.1％。因此，S.cerevisiaeS288C中轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.58)是3-甲硫基丙醇生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，其增強(qiáng)轉(zhuǎn)氨酶基因ARO9的克隆及基因表達(dá)，有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代謝流量。
　　同理，將脫羧酶基因ARO10與穿梭質(zhì)粒pYES2連接，構(gòu)建了釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒pYES2-ARO10。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，使用醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化到INVSc1中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，構(gòu)建的釀酒酵

4、母轉(zhuǎn)化子SC10-1能夠過量生產(chǎn)3-甲硫基丙醇，發(fā)酵120h時(shí)，其生成量比未導(dǎo)入的對(duì)照菌株，其3-甲硫基丙醇產(chǎn)量提高55.2%。因此，S.cerevisiaeS288C中脫羧酶(EC4.1.1.72)是3-甲硫基丙醇生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶之一，過表達(dá)脫羧酶基因ARO10，有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代謝流量。
　　2.在原養(yǎng)型釀酒酵母S288C中，分別過表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶基因（ARO9）和脫羧酶基因（ARO10），獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)化子GSO

5、9和GSO10；并對(duì)已構(gòu)建成功的基因工程菌株GSO9、工程菌株GSO10和宿主菌S288C進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
　　發(fā)酵結(jié)果表明：當(dāng)發(fā)酵85h時(shí)，工程菌株GSO9的3-甲硫基丙醇生成量基本穩(wěn)定，最大生成量為1.07g/L，對(duì)照菌株S288C中3-甲硫基丙醇的最大生成量0.97g/L，工程菌株GSO9發(fā)酵過程中，3-甲硫基丙醇的生成量比對(duì)照菌株S288C提高10.3%。當(dāng)發(fā)酵95h時(shí)，工程菌株GSO10的最大生成量為1.23g/L，對(duì)

6、照菌株S288C中3-甲硫基丙醇的最大生成量1.02g/L，在工程菌株GSO10發(fā)酵過程中，3-甲硫基丙醇的生成量比對(duì)照菌株S288C提高20.6%。上述研究為進(jìn)一步高產(chǎn)3-甲硫基丙醇的釀酒酵母基因工程菌株的代謝通量分析提供材料和根據(jù)。
　　3.基于構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)，對(duì)釀酒酵母S288C和兩株過表達(dá)工程菌株GSO9和GSO10，進(jìn)行了代謝通量分析，研究了分別過表達(dá)釀酒酵母自身的轉(zhuǎn)氨酶（EC2.6.1.58）和脫羧酶（EC4.1.1.