人參稀有皂苷Compound K的酶法制備及其混合膠束的研究.pdf

1、中藥活性成分目前主要是通過分離提取的方法得到，然而，很多活性成分例如紫杉醇、淫羊藿苷元和銀杏內(nèi)酯等很難大量制備，并且這些中藥活性成分口服生物利用度很低，限制了其臨床療效的發(fā)揮。
　　人參稀有皂苷Compound K(CK)是五加科人參屬植物人參的一種二醇型稀有人參皂苷，被世界各個(gè)國家廣泛用于疾病的預(yù)防和治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，人參稀有皂苷CK在抗腫瘤、抗糖尿病、神經(jīng)保護(hù)、抗衰老及抗炎等方面都具有明顯的作用，是人參皂苷中抗癌活性最強(qiáng)的

2、稀有皂苷之一，具有很強(qiáng)的潛在開發(fā)能力。研究表明，CK在植物中的含量較低，單純分離提取難以滿足應(yīng)用需求，并且難溶于水、口服溶出速率慢、存在嚴(yán)重的P-gp外排，導(dǎo)致其口服生物利用度低，限制了療效的發(fā)揮。針對這些問題，筆者提出采用生物酶解的方法解決制備人參稀有皂苷CK困難的問題，采用混合膠束制劑技術(shù)提高其生物利用度。
　　筆者首次提出采用蝸牛酶制備CK，研究了蝸牛酶水解人參皂苷Rb1制備CK的工藝條件，對影響人參稀有皂苷CK轉(zhuǎn)化率的各個(gè)

3、因素進(jìn)行探討，通過響應(yīng)面法對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳酶解工藝。在此基礎(chǔ)上筆者還對基本的生物轉(zhuǎn)化方法做了更深入的研究，提出了超聲輔助酶解人參總皂苷制備CK和微球固定化蝸牛酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備CK的兩種研究思路。在制備得到CK之后，對其生物藥劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，選擇適宜的劑型改善其吸收存在的問題。以維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯和大豆磷脂為聯(lián)合載體，采用溶劑揮發(fā)法制備CK混合膠束，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)篩選最佳制備工藝;考察形態(tài)、粒徑、包封率

4、、載藥量、體外釋放度;并通過Caco-2細(xì)胞模型評價(jià)其轉(zhuǎn)運(yùn)吸收特性和在大鼠體內(nèi)的生物利用度評價(jià)。
　　蝸牛酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備CK的研究結(jié)果表明，酶水解法作為一種綠色安全的方法，能夠很好地保持產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，更加適合工業(yè)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)酶解反應(yīng)的最優(yōu)條件為溫度55℃、pH5.5醋酸-醋酸鈉緩沖液，底物濃度1.0 mg·mL-1，酶與底物質(zhì)量比1∶1，反應(yīng)時(shí)間36 h，在此條件下的轉(zhuǎn)化率為40.01％。經(jīng)驗(yàn)證，優(yōu)化得到的預(yù)測結(jié)果與實(shí)驗(yàn)

5、結(jié)果吻合較好。此外，本課題組同時(shí)也在研究人參稀有皂苷其他單體，以期為人參稀有皂苷組分的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為中藥稀有活性組分新產(chǎn)品開發(fā)提供了有效手段。
　　超聲輔助酶解人參總皂苷制備人參稀有皂苷Compound K的研究結(jié)果表明，采用超聲波輔助酶解的方法，人參稀有皂苷CK的轉(zhuǎn)化率從3.27％提高到6.91％。原因主要是利用超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械振動等作用，促使底物與酶變成微小的粒子，接觸面積變大，能更充分的結(jié)合，進(jìn)一步便

6、于蝸牛酶發(fā)揮酶解作用。
　　微球固定化蝸牛酶制備人參稀有皂苷CK的研究結(jié)果表明，固定化蝸牛酶熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和固定化蝸牛酶的貯存壽命都得到了有效的改善;同時(shí)，蝸牛酶的固定化可以保護(hù)酶的結(jié)構(gòu)而不受酶解環(huán)境的變化而變化;而且可以通過離心或過濾等簡單的方法分離固定化酶，然后進(jìn)行回收利用。因此，本研究為提高固定化蝸牛酶的轉(zhuǎn)化效率，擴(kuò)大應(yīng)用范圍提供了實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　本研究以維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯和大豆磷脂為聯(lián)

7、合載體，采用溶劑揮發(fā)法制備人參稀有皂苷Compound K混合膠束，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)篩選最佳制備工藝;考察形態(tài)、粒徑、包封率、載藥量、體外釋放度;并通過Caco-2細(xì)胞模型評價(jià)其轉(zhuǎn)運(yùn)吸收特性。結(jié)果表明，混合膠束的最佳制備工藝為人參稀有皂苷CK的投料量1.0 mg，維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯和大豆磷脂比例為1∶1，水化體積10 mL;制備得到的混合膠束呈球形或類球形，平均粒徑為110±2.69 nm，平均包封率為(92.23±2.76)

8、％，平均載藥量為(4.32±0.19)％;體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該混合膠束具有一定的緩釋能力。Caco-2細(xì)胞模型顯示混合膠束促進(jìn)了CK的吸收，且外排性有一定的減弱。
　　生物利用度的研究結(jié)果表明，制備成CK混合膠束后，由于改善了原料藥的溶出，從而促進(jìn)了吸收，改善了生物利用度。對于以TPGS和大豆磷脂為聯(lián)合載體的人參稀有皂苷CK混合膠束而言，一方面，由于載體TPGS有效抑制了P-gp外排和大豆磷脂的生物相容性;另一方面，形成混合膠束