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文檔簡介
1、第一部分自身免疫性心肌炎小鼠miR-155和Th17/Treg表達(dá)研究
目的:檢測實驗性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠 miRNA-155表達(dá)情況和Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)免疫反應(yīng)。
方法:建立BABL/C小鼠α肌球蛋白重鏈(MyHC-α)來源多肽誘導(dǎo)的EAM模型;觀察并比較各組小鼠心臟和脾臟外觀變化,測量并比較各組小鼠體重變化、心臟質(zhì)量/體重比率(HW/BW)、心臟質(zhì)量/脛骨長度比值(HW/TL)和脾臟總淋巴細(xì)胞
2、數(shù);HE染色檢測小鼠心臟組織病理改變;原位雜交檢測小鼠心肌組織miR-155表達(dá)情況;RT-PCR檢測小鼠心肌組織、外周血單個核細(xì)胞,脾臟淋巴細(xì)胞,脾臟CD4+T細(xì)胞的miR-155表達(dá)情況;Western blot和RT-PCR檢測小鼠心肌組織Th17相關(guān)細(xì)胞因子(RORγt、IL-6、IL-17A)表達(dá)情況;流式檢測小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例,以及小鼠脾臟CD11c+樹突狀細(xì)胞(DCs)比例;West
3、ern blot和RT-PCR檢測Th17相關(guān)細(xì)胞因子(RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22)和Treg相關(guān)細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10、IL-35)表達(dá)情況,以及CD11c+DC表達(dá)促Th17細(xì)胞分化炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23)水平;磁珠分選 EAM小鼠和正常對照小鼠的CD4+CD25+foxp3+Treg細(xì)胞和CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞體外進行混合培養(yǎng)和交叉培養(yǎng),檢測EAM模型小鼠Tr
4、eg細(xì)胞抑制功能。
結(jié)果:與健康對照組相比,EAM模型小鼠心肌組織、外周血單個核細(xì)胞,脾臟CD4+T細(xì)胞的miR-155表達(dá)明顯升高,并且免疫組化顯示,小鼠心肌組織表達(dá)的miR-155主要位于炎癥侵潤部位,而未受損的心肌組織則miR-155表達(dá)不明顯;EAM模型小鼠心肌組織Th17相關(guān)細(xì)胞因子(RORγt、IL-6、IL-17A)表達(dá)明顯升高;EAM模型小鼠脾臟 CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例明顯升高,同時 Th17相關(guān)細(xì)胞
5、因子(RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22)表達(dá)明顯升高;EAM模型小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Treg細(xì)胞比例相比對照組無明顯變化,但Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10、IL-35)表達(dá)明顯升高;EAM模型小鼠脾臟CD11c+DCs比例升高,DC表達(dá)促Th17細(xì)胞分化炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23)水平升高。CFSE標(biāo)記效應(yīng)性T細(xì)胞檢測Treg細(xì)胞抑制功能試驗表明EAM模型小鼠脾臟來源的T
6、reg細(xì)胞抑制功能無明顯變化,但其CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞對Treg細(xì)胞抑制作用的反應(yīng)敏感度明顯降低。
結(jié)論:EAM小鼠心肌組織及脾臟CD4+T細(xì)胞miR-155表達(dá)明顯升高,同時EAM小鼠存在明顯的Th17/Treg細(xì)胞失衡,一方面表現(xiàn)為增殖失衡,即CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例明顯升高,而 Treg細(xì)胞雖然也有增殖但其比例無明顯變化;另一方面表現(xiàn)為功能失衡,即Th17細(xì)胞對Treg細(xì)胞的抑制功能產(chǎn)生抵抗,而Treg細(xì)
7、胞的本身的抑制功能并無明顯變化;EAM小鼠體內(nèi)CD11c+DCs分泌促Th17細(xì)胞分化所需炎癥因子的水平明顯增加。
第二部分 MiR-155促進自身免疫性心肌炎小鼠Th17細(xì)胞的分化和功能
目的:探索miR-155對實驗性自身免疫性心肌炎(EAM)中Th17和Treg細(xì)胞分化及其功能的影響;研究體內(nèi)抑制miR-155對自身免疫性心肌炎的治療作用。
方法:建立 BALB/c小鼠 EAM模型。通過尾靜脈注射 m
8、iRNA-155抑制劑(antagomir-155)抑制小鼠體內(nèi)miR-155的表達(dá),尾靜脈注射PBS作為抑制劑對照。動物分組:對照組(尾靜脈注射 PBS),對照組(尾靜脈注射 antagomir-155),EAM模型組(尾靜脈注射PBS),EAM模型組(尾靜脈注射antagomir-155)。觀察并比較各組小鼠心臟外觀變化,測量并比較各組小鼠體重變化,心臟質(zhì)量/體重比率(HW/BW),心臟質(zhì)量/脛骨長度比值(HW/TL),脾臟總淋巴細(xì)
9、胞數(shù);組織病理學(xué)檢查和心臟超聲檢查比較各組小鼠心肌炎程度及心臟形態(tài)功能變化;RT-PCR檢測各組小鼠心肌組織、PBMCs、脾臟淋巴細(xì)胞的miR-155表達(dá)情況;Western blot和RT-PCR檢測各組小鼠心肌組織Th17相關(guān)細(xì)胞因子(RORγt、IL-6、IL-17A)表達(dá)情況;免疫組化檢測EAM模型小鼠IL-17A表達(dá)情況;分離EAM模型小鼠心肌炎性細(xì)胞,流式檢測Th17細(xì)胞表達(dá)情況;流式檢測各組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Th17
10、細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例,以及小鼠脾臟CD11c+樹突狀細(xì)胞(DCs)比例;Western blot和RT-PCR檢測Th17相關(guān)細(xì)胞因子(RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22)和Treg相關(guān)細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10、IL-35)表達(dá)情況,以及 CD11c+DC表達(dá)促 Th17細(xì)胞分化炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23)水平。分離兩組EAM模型小鼠脾臟細(xì)胞體外進行MyHC-α614-629多肽特
11、異性增殖反應(yīng),比較兩組小鼠來源CD4+T細(xì)胞增值狀況及分泌IL-17A細(xì)胞因子水平。
結(jié)果:與尾靜脈注射PBS的EAM模型組小鼠對比,antagomir-155處理的EAM模型小鼠具有以下變化:心肌組織、PBMCs、脾臟淋巴細(xì)胞的miRNA-155表達(dá)明顯降低;心肌炎癥侵潤、壞死、纖維化明顯改善;體重減輕百分比,HW/BW、HW/TL及總淋巴細(xì)胞數(shù)明顯降低;心臟形態(tài)及功能明顯改善;心肌組織Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子(RORγt、
12、IL-6、IL-17A)明顯減少;小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例,以及小鼠脾臟CD11c+DCs比例明顯減少;小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞Th17相關(guān)細(xì)胞因子(RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22)和Treg相關(guān)細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10、IL-35)表達(dá)明顯降低;小鼠脾臟CD11c+DC表達(dá)促Th17細(xì)胞分化炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23)明顯減少。MyHC-α多肽特異性
13、增殖反應(yīng)顯示 antagomir-155處理的EAM模型小鼠來源 CD4+T細(xì)胞體外抗原特異性增殖反應(yīng)明顯降低,并且分泌IL-17A細(xì)胞比例也明顯降低。
結(jié)論:通過尾靜脈注射 miR-155抑制劑 antagomir-155可以特異性干預(yù)小鼠體內(nèi)miR-155的表達(dá)及其功能;體內(nèi)抑制miR-155對EAM小鼠起著明顯的心臟保護作用,說明miR-155促進EAM的發(fā)生發(fā)展;體內(nèi)抑制miR-155能夠明顯減弱EAM小鼠Th17細(xì)胞
14、的活化及其促炎效應(yīng),說明miR-155通過促進Th17細(xì)胞的分化和功能介導(dǎo)EAM小鼠Th17/Treg失衡;體內(nèi)抑制miR-155明顯降低了EAM小鼠CD11c+DCs的表達(dá)及其分泌Th17細(xì)胞極化因子的水平,說明miR-155可通過促進DCs的分化和分泌炎癥因子的功能間接促進Th17細(xì)胞的表達(dá)。
第三部分體外研究miR-155對Th17細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的分化及功能的影響
目的:通過體外過表達(dá)或抑制 miRNA-15
15、5的細(xì)胞培養(yǎng)實驗進一步研究 miR-155對Th17細(xì)胞和骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDCs)的分化及其功能的影響。
方法:磁珠分選健康BALB/C小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞,分別體外轉(zhuǎn)染miR-155類似物(agomir-155)、miR-155抑制劑(antagomir-155)和各自對照劑(agomir-NC和antagomir-NC),再進行 Th17細(xì)胞分化培養(yǎng)。收集培養(yǎng)上清液 ELISA檢測各組細(xì)胞IL-17A分泌情況;流
16、式檢測各組細(xì)胞 Th17細(xì)胞分化比例;RT-PCR檢測各組細(xì)胞miR-155、Th17細(xì)胞相關(guān)因子(IL-17A、RORγt、STAT3)及miR-155靶基因SOCS-1表達(dá)情況。分離健康 BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞,體外刺激誘導(dǎo) BMDCs生成,轉(zhuǎn)染antagomir-155或antagomir-NC,LPS刺激成熟。收集培養(yǎng)上清液ELISA檢測各組細(xì)胞促炎因子IL-6、IL-23、TNF-α和IL-1β分泌情況;流式檢測各組細(xì)胞表面
17、標(biāo)志MHCⅡ、CD86、CD11c表達(dá)情況;RT-PCR檢測各組細(xì)胞miR-155,促炎因子IL-6、IL-23、TNF-α和IL-1β,以及miR-155靶基因SOCS-1、PU.1、SHIP-1表達(dá)情況。
結(jié)果:過表達(dá)miR-155的CD4+T細(xì)胞體外分化Th17細(xì)胞比例、分泌IL-17A細(xì)胞因子、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt及STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子表達(dá)都明顯增加,而miR-155靶基因SOCS-1表達(dá)則明顯降低;miR-155
18、表達(dá)受抑制的CD4+T細(xì)胞體外分化Th17細(xì)胞比例、分泌IL-17A細(xì)胞因子、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt及STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子表達(dá)都明顯降低,而 miR-155靶基因 SOCS-1表達(dá)則明顯增加。 miR-155表達(dá)受抑制的BMDCs經(jīng)LPS刺激后其成熟表面標(biāo)志MHCⅡ、CD86、CD11c表達(dá)無明顯變化,而分泌炎因子 IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23的功能則明顯降低,同時 miR-155靶基因SOCS-1、PU.1、SHIP
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