狂犬疫苗糖蛋白及乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標記時間分辨免疫分析試劑的研制.pdf

1、目的:
　　本研究采用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)研制狂犬病毒糖蛋白及甲胎蛋白和乙肝表面抗原的雙標記定量檢測試劑，評價各項性能指標，并與其它檢測試劑盒進行比較，評價其在臨床檢測應用中的可行性。
　　方法:
　　采用雙抗體夾心法研制狂犬疫苗糖蛋白及甲胎蛋白和乙肝表面抗原雙標記時間分辨熒光免疫分析試劑。
　　一、人用狂犬疫苗糖蛋白定量檢測試劑的研制與應用
　　1.狂犬病毒糖蛋白抗原的制備:根據(jù)狂犬病毒CTN株G基因

2、膜外序列設計引物，提取狂犬病毒CTN株總RNA，采用AMV酶逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用PCR的方法從cDNA中擴增G基因，將該基因片段定向克隆到原核表達載體p ET32a(+)中，構(gòu)建原核表達載體p ET32a/G。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達宿主菌BL21(DE3)，用IPTG誘導表達并確定表達G基因的最佳誘導時間。SDS-PAGE和Western-blot對表達產(chǎn)物進行檢測和分析。
　　2.人用狂犬病毒抗糖蛋白單克隆抗體的制備:以狂

3、犬疫苗制劑為抗原免疫Bal/C小鼠，效價達到1∶64000后，采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體，使用狂犬病毒原液、人血清白蛋白及狂犬病毒核蛋白進行篩選對抗體進行初步篩選，篩出48株疑似糖蛋白單抗。
　　3.單克隆抗體的純化:用Protein G Sepharose4 Fast flow親和層析柱純化，并用BCA試劑盒測抗體濃度。
　　4.銪標記抗體與純化:超濾管純化抗體后，按質(zhì)量比5∶1與銪標記試劑充分混勻，25℃振蕩過夜

4、，次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化，同時收集流出液(1ml/管)，收集液逐管取樣測量熒光信號值，合并信號峰值的收集管，加10％ BSA保護劑，-20℃保存。
　　5.特異性糖蛋白抗體的篩選及配對:先用狂犬病毒原液作為雙抗夾心的標準品，將48株抗糖蛋白單抗逐一包被，與另外47株銪標抗體配對，繪制標準曲線，篩出配較佳的配對組合，再用自制糖蛋白抗原和企業(yè)標準品作為標準品，從中繪制標準曲線，最終篩出配對得上的單抗。

5、>　　6.參考標準品的配備用標準品緩沖液將糖蛋白抗原配制成0、31.25、62.5、125、250和250 mEu/L系列參考標準溶液，每瓶1ml分裝凍干4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　7.試劑性能指標的評價
　　二、采用雙抗體夾心法研制乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標記時間分辨熒光免疫定量檢測分析試劑。
　　1.用標準品稀釋液將AFP抗原配制成系列濃度為:0mIU/L、2 mIU/L20mIU/L、200 mIU/L、1000 mIU

6、/L和2000 mIU/L;同時用標準品稀釋液將HBsAg抗原配制成系列濃度為:0μg/L、0.4μg/L、2μg/L、10μg/L、50μg/L和300μg/L;再將兩種母液分別從低濃度到高濃度按1∶1混勻，最后AFP(mIU/L)/ HBsAg（μg/L）標準品濃度為:0/0、1/0.2、10/1、100/5、500/25和1000/150;每瓶1ml分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2.固相包被抗體用包被液將AFP和HBsAg包

7、被抗體稀釋后，一同加入96微孔板中包被，37℃震蕩2小時后，4℃過夜，37℃封閉3小時，真空抽干，4℃保存。
　　3.Eu3+標記抗體制備超濾管純化抗體后，按質(zhì)量比5∶1與銪標記試劑充分混勻，25℃振蕩過夜，次日過SephadexTMG-50凝膠層析柱純化，同時收集流出液(1ml/管)，逐管測量熒光信號值，合并峰管，加10％ BSA保護劑，-20℃保存。
　　4.Sm3+標記抗體制備超濾管純化抗體后，按質(zhì)量比2∶1與釤標記試

8、劑充分混勻，25℃振蕩過夜，次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化，同時收集流出液(1ml/管)，然后逐管測定熒光信號值，合并峰管，加入10％濃度的BSA作保護劑，-20C保存。
　　5.試劑性能指標的評價
　　5.1 標準曲線的繪制
　　以自制試劑中參考標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，信號值的對數(shù)為縱坐標，由雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理，繪圖軟件采用OriginPro7.5 SR1(Microcal，U

9、SA)。
　　5.2 靈敏度實驗
　　以零參考標準品當作樣品測量20次，計算其均值及標準差。以其測定值的均值加上2倍的標準差所得信號值再減去本底信號值，代入標準曲線方程計算所得出的濃度，即為其靈敏度。
　　5.3 準確度實驗
　　以自制參考品為對照品，計算試劑參考標準品的實測濃度與標示濃度的比值。
　　5.4 精密度實驗
　　精密度實驗采用自制的低、中、高3個質(zhì)控品（質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）進行測定，分析內(nèi)

10、精密度實驗設置復孔，分析間精密度實驗設多次測定，計算各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標準差及CV值。
　　5.5 稀釋線性實驗
　　使用標準緩沖液將已知濃度的血清樣本從1/2至1/32連續(xù)倍比稀釋進行平行度分析。
　　5.6 干擾實驗
　　檢測本實驗研發(fā)的分析試劑在干擾性物質(zhì)（溶血、高血脂、高膽紅素）存在的情況下檢測標本的準確性。按試劑操作說明書對加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的陽性標本進行測定，計算其回收率。
　

11、　5.7 與國外試劑的比較實驗
　　同時采用自制試劑及雅培化學發(fā)光兩種試劑盒檢測血清樣本，使用統(tǒng)計軟件分析測值相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　一、成功從狂犬CTN株獲取目的基因，并構(gòu)建p ET32a/G重組質(zhì)粒，重組蛋白在BL21(DE3)宿主菌中以包涵體的形式表達，通過包涵體洗滌、Ni離子親和層析以及透析復性后抗體鑒定得到了純度較高的有活性的狂犬病毒糖蛋白抗原。采用單克隆抗體制備的經(jīng)典方案，以狂犬疫苗制劑免疫小鼠，取脾進行

12、細胞融合成功制備出48株疑似狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體細胞株，進一步采用糖蛋白抗原篩選出符合使用要求的特異性糖蛋白單克隆抗體配對組合（S036-S053EU3+）。并以特異性糖蛋白單克隆抗體配對組合(S036-S053EU3+)為基礎(chǔ)成功研制出狂犬疫苗糖蛋白時間分辨熒光免疫分析試劑，自制試劑參考品實測濃度與標示濃度的比值在0.90-1.10之間;靈敏度為0.098 mEU/mL，在樣品濃度超過2000 mEU/mL將出現(xiàn)HOOK效應;試劑

13、分析內(nèi)變異系數(shù)和分析間變異系數(shù)均不超過10％;與狂犬核蛋白無交叉反應;189份狂犬病毒樣品采用自制試劑和武漢病毒研究所糖蛋白ELISA檢測試劑盒武漢進行平行檢測，對所測數(shù)值進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩種方法所得的數(shù)值相關(guān)性良好:Y=1.00X+1.38，R2=0.912，P＜0.0001;通過效力實驗所得數(shù)據(jù)做出糖蛋白濃度與參考疫苗和各樣品疫苗的線性關(guān)系，并計算出TRFIA所測得的疫苗效力值(T-NIH)。同時對TRFIA和NIH動物法所

14、測得的39份疫苗效力值進行趨勢和相關(guān)性分析，結(jié)果兩種方法所得的數(shù)值趨勢一致，相關(guān)性良好:Y=0.930X+0.114，R2=0.903，P＜0.0001，兩種方法所測的數(shù)值進行配對t檢驗，結(jié)果顯示:t0.05/2,38=-1.223，P=0.229＞0.05，表明兩種方法所測的數(shù)值差異無統(tǒng)計學意義。
　　二、自制乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標記時間分辨熒光免疫免疫分析試劑在檢測AFP和HBsAg的分析靈敏度分別為0.09 mIU/L和

15、0.01μg/L。檢測范圍分別為1-1000 mIU/L和0.2-150μg/L，在檢測AFP時分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別為3.3-4.1％和5.7-7.2％，而在檢測HBsAg時分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別為2.9-3.9％和4.9-6.8％。自制試劑臨床血清樣本測值同化學發(fā)光法測值相關(guān)性良好(R2AFP=0.989，P＜0.0001;R2HBsAg=0.988，P＜0.0001)，兩種方法所測的數(shù)值進行配對t檢驗，結(jié)果顯示:tAFP0

16、.05/2,111=-0.846，P=0.399＞0.05; tHBsAg0.05/2,82=0.557，P=0.579＞0.05，可以認為兩種方法所測數(shù)值的差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　上述結(jié)果表明本研究研制的狂犬疫苗糖蛋白及乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標記時間分辨熒光免疫分析試劑的各項指標（準確性、靈敏度、精密度和抗干擾性等）均達到檢測試劑的使用要求，狂犬疫苗糖蛋白時間分辨熒光免疫分析試劑疫苗樣品測值與NIH法測值有良