乙肝表面抗原S蛋白與纖維蛋白原α鏈相互作用的驗證及功能學研究.pdf

1、目的：證實纖維蛋白原α鏈（FGA）作為乙型肝炎表面抗原S蛋白(HBS)結(jié)合蛋白一種候選蛋白,探討二者相互作用后在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學功能。
　　方法：1.提取人HepG2細胞RNA，用RT-PCR方法擴增出FGA基因。將PCR產(chǎn)物克隆進真核載體pcDNA6內(nèi)，構(gòu)建含F(xiàn)GA基因的重組真核表達質(zhì)粒。同樣利用PCR技術(shù)，以HBS質(zhì)粒為模板擴增HBS基因,構(gòu)建pCMV4-Flag-HBS基因表達質(zhì)粒(實驗室已構(gòu)建成功)，分別將重組質(zhì)

2、粒轉(zhuǎn)染293FT細胞，用免疫熒光和Western blot等方法檢測FGA及HBS在293FT細胞中的表達。2.通過免疫共沉淀方法以及激光共聚焦試驗驗證HBS蛋白與FGA相互結(jié)合并明確HBS和FGA空間定位。3.構(gòu)建靶向FGA重組干擾質(zhì)粒siFGA-Pu6,轉(zhuǎn)染HepG2細胞以及HBS的穩(wěn)轉(zhuǎn)株中，篩選出4種穩(wěn)轉(zhuǎn)株（pCMV4+pU6,pCMV4+siFGA,HBs+pU6,and HBs+siFGA）。通過細胞CCK-8增殖實驗、細胞凋

3、亡實驗、Transwell實驗，探討FGA在肝癌細胞HepG2生長、侵襲、凋亡等方面的作用。通過蛋白芯片以及western blot實驗進一步研究其分子機制。
　　結(jié)果：(1)Western blot結(jié)果顯示：FGA抗體孵育在72KD位置有目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致；HBS抗體孵育在約26KD位置有預(yù)期蛋白表達。免疫熒光結(jié)果顯示：FGA蛋白與HBS蛋白二者共同存在于細胞質(zhì)中。（2）內(nèi)源性免疫共沉淀結(jié)果：成功確認FGA是HBsAg中小

4、S蛋白（HBS）結(jié)合蛋白一種候選蛋白。（3）細胞功能學研究表明：FGA蛋白與HBS蛋白結(jié)合后的HepG2細胞增殖加快、凋亡增快、遷移與侵襲能力未見明顯變化。而FGA蛋白表達或者高表達HBS蛋白的細胞均促進增殖，單獨表達FGA的細胞抑制凋亡、遷移與侵襲能力，單獨表達HBS的細胞促進凋亡、遷移與侵襲能力。（4）干擾細胞中FGA的表達后，可抑制信號通路中促增值因子Bcl-XL和Mcl-1的表達，并增加促凋亡因子蛋白的表達，并促使HepG2細胞