基因工程菌全細胞催化制備葡甘低聚糖.pdf

1、葡甘低聚糖是一種水溶性的高分子多糖，它作為功能性低聚糖，可以改善動物腸道微生物菌群，提高機體的免疫功能及抗氧化性等，廣泛應用于食品、藥品以及飼料行業(yè)。其特殊的生理功能和廣泛的應用前景，極大地引起了學者們的興趣。本文通過含有β-甘露聚糖酶基因的重組工程菌利用全細胞催化的方式制備葡甘低聚糖，并對其酶解工藝條件進行響應面優(yōu)化，之后對酶解產(chǎn)物進行薄層色譜和高效液相檢測，并對酶解產(chǎn)物進行脫色和去單糖處理。
　　Rossate-pET32a-

2、CH3是本實驗室構(gòu)建的含有β-甘露聚糖酶基因的重組工程菌，酶活力較高。該重組工程菌利用全細胞催化的方式水解魔芋粉制備葡甘低聚糖，通過單因素優(yōu)化分析，探究不同酶解溫度、酶解時間、pH值、底物濃度以及加酶量對魔芋粉水解率的影響。單因素優(yōu)化結(jié)果顯示，酶解反應的最佳溫度為50℃，最佳時間為12h，最佳pH值為7.0，最佳底物濃度為3％，最佳酶量為1000 U。由于酶解時間和加酶量這兩個因素對魔芋粉水解率的影響顯著性不明顯，選取反應溫度(A)、底

3、物濃度(B)、pH值(C)為三個變量，以酶解反應的水解率Y為響應面值，利用Design-Expert軟件根據(jù)Box-Behnken的原理設計試驗方案，并進行試驗和統(tǒng)計分析，最終確定了利用全細胞催化方式水解魔芋粉的最佳工藝條件:反應溫度為50.6℃，底物濃度為3.4％，pH值為6.8。使得最終的魔芋粉水解率達到了41.34％，與預測值41.541％相吻合。
　　薄層色譜法(TLC)檢測具有成本低，檢測速度快，操作簡便等優(yōu)點，因此，本

4、研究對酶解產(chǎn)物的檢測采用薄層色譜法進行。根據(jù)響應面優(yōu)化得到的最佳酶解工藝條件，制備葡甘低聚糖。將反應結(jié)束后的酶解液離心取上清，與含有甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖的標準品混合液分別點樣于Sillca gel60硅膠板中，進行薄層色譜分析。分析結(jié)果顯示，酶解產(chǎn)物中主要成分為甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖，不含有或者含有極少量的單糖;高效液相色譜分析顯示產(chǎn)物只占總物質(zhì)含量的22.64％。
　　利用酵母發(fā)酵的方式去除酶解產(chǎn)物中含有的

5、單糖，并通過單因素優(yōu)化和正交試驗優(yōu)化，探究酵母去除單糖的最佳條件。單因素優(yōu)化結(jié)果顯示，酵母去除單糖的最佳條件:發(fā)酵時間為22 h，底物濃度為2％，酵母添加量為2％。經(jīng)過正交試驗后，優(yōu)化結(jié)果顯示，這三個因素對單糖去除率影響程度逐次排序為:底物濃度(C)＞發(fā)酵時間(A)＞酵母添加量(B)。酵母去除單糖的最佳條件為C3A1B2，即發(fā)酵時間24 h，底物濃度1％，酵母添加量2％。在最佳條件下，單糖去除率達到了69.50％。
　　利用活性炭