新型漁用基因工程菌蛻疫苗的研制.pdf

1、菌蛻(Bacterial ghosts，BGs)是沒有內(nèi)容物的完整細(xì)菌外殼。通過PhiX174溶菌基因E的表達在革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜表面形成跨膜孔道，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物的丟失，形成菌蛻。菌蛻形成過程不引起細(xì)胞表面其他結(jié)構(gòu)的理化變化，因此它能夠保持與活菌細(xì)胞膜相似的形態(tài)、黏附性、細(xì)菌表面抗原等特性，可以有效誘導(dǎo)機體的體液、細(xì)胞免疫應(yīng)答及增強粘膜免疫反應(yīng)。
　　本實驗以菌蛻為基礎(chǔ)，擬制備出安全、高效的漁用基因工程疫苗。根據(jù)噬菌體 PhiX1

2、74溶菌基因E的序列，設(shè)計含有EcoR I、Sal I酶切位點的引物。利用PCR技術(shù)擴增出 E基因片段，連接到 pMD18-T載體上，構(gòu)建了克隆載體 pT-E。測序發(fā)現(xiàn) E基因第20位堿基發(fā)生了致死突變，因而導(dǎo)致 E基因不能正常表達。根據(jù)突變位點的位置，通過延長引物序列修正突變位點，從而得到了正確的溶菌基因 E序列。將其連接到具有溫控表達系統(tǒng)cI857-PR/PL的表達載體 pBV220上，成功構(gòu)建了氨芐青霉素抗性溶菌質(zhì)粒 pBV-El

3、ysislysis。將溶菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DE3，使用氨芐青霉素篩選出陽性克隆。當(dāng)含有溶菌質(zhì)粒的大腸桿菌在28℃生長到對數(shù)期，OD600約為0.3時，通過升高溫度至42℃誘導(dǎo) E基因表達。誘導(dǎo)開始后，每20min取樣測定菌液吸光度，并取菌液涂布培養(yǎng)，檢測活菌數(shù)量。誘導(dǎo)20min后，E基因表達明顯，菌液吸光度開始下降。隨著誘導(dǎo)時間延長，菌液吸光度緩慢降低至平衡，活菌數(shù)迅速下降。誘導(dǎo)3h后溶菌完全，得到了大腸桿菌菌蛻，溶菌效率達到100

4、％。溶菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入野生鞘氨醇假單胞菌，誘導(dǎo)0.5h后開始溶菌，誘導(dǎo)7h后溶菌效率達99.994±0.005％。經(jīng)掃描電鏡觀察，可以看到明顯的溶菌孔道。
　　由于近些年來抗生素的濫用，導(dǎo)致了多數(shù)水生致病菌對氨芐青霉素均不敏感，轉(zhuǎn)化后很難篩選出正確的陽性克隆，因此本實驗又進一步構(gòu)建了具有慶大霉素抗性的廣宿主溶菌質(zhì)粒 pBM-C-Elysis。構(gòu)建的廣宿主質(zhì)粒仍然采用溫控表達系統(tǒng)cI857-PR/PL實現(xiàn) E基因的可調(diào)控表達。根據(jù)溫控溶

5、菌盒和廣宿主載體 pBBR-MCS-5的序列，設(shè)計含有BamH I、Xho I酶切位點的引物，利用PCR技術(shù)擴增出溫控溶菌盒，直接雙酶切后連接到經(jīng)過相同酶切的pBBR-MCS-5載體上，成功構(gòu)建了具有慶大霉素抗性的廣宿主溶菌質(zhì)粒 pBM-C-Elysis。將溶菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DE3表達菌中，28℃擴大培養(yǎng)大腸桿菌至對數(shù)生長期，OD600約為0.4時，開始升高溫度至42℃。熱誘導(dǎo)40min后，開始溶菌，菌液吸光度有所降低。誘導(dǎo)2h后

6、，菌液吸光度基本保持穩(wěn)定；熱誘導(dǎo)40min后，活菌數(shù)迅速降低；誘導(dǎo)4h后溶菌效率為99.9999±0.0001％。溶菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入野生豚鼠氣單胞菌中，熱誘導(dǎo)1h后，菌液吸光度開始下降并趨于平穩(wěn)；誘導(dǎo)1h后，活菌數(shù)迅速降低；誘導(dǎo)5h后，溶菌效率達99.9997±0.0003％，低壓冷凍干燥后無活菌。掃描電鏡下可觀察到明顯的溶菌孔道，并且溶菌孔道只占細(xì)菌表面很少一部分，其他結(jié)構(gòu)并未受到破壞。
　　豚鼠氣單胞菌能夠引起多種魚類疾病。將制備