利用19F位點(diǎn)特異性標(biāo)記和19F核磁共振方法的原位蛋白質(zhì)相互作用和功能分析.pdf

1、此論文中主要討論了非天然氨基酸標(biāo)記的方法和應(yīng)用，19F NMR的優(yōu)勢(shì)和在各領(lǐng)域中的應(yīng)用。我們結(jié)合非天然氨基酸標(biāo)記和19F NMR來(lái)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，本論文共分為六個(gè)章節(jié)。
　　第一章介紹了非天然氨基酸標(biāo)記的方法及其應(yīng)用。通過(guò)非天然氨基酸的引入來(lái)研究生物學(xué)過(guò)程，可以解決傳統(tǒng)方法無(wú)法解決的一些問(wèn)題。將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性引入最有力的方法是通過(guò)遺傳密碼子擴(kuò)增，該方法在需要標(biāo)記的位置引入琥珀密碼子(TAG)突變，篩選到能識(shí)別琥珀密

2、碼子的氨酰tRNA合成酶/tRNA對(duì)將非天然氨基酸引入，另外，可以通過(guò)化學(xué)連接方法輔助這種非天然氨基酸引入的方法。非天然氨基酸也可以通過(guò)選擇壓力的方法以氨基酸特異性的方式引入，這種方法會(huì)導(dǎo)致基因組特定氨基酸全方面的標(biāo)記，而不是定點(diǎn)標(biāo)記。本章還重點(diǎn)介紹了氨基酸特異性和位點(diǎn)特異性兩種非天然氨基酸標(biāo)記方法在各方面的應(yīng)用以及在一些前沿科技方面的應(yīng)用。
　　第二章介紹了利用19F NMR研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。19F自旋量子數(shù)為1/2，自然

3、豐度是100％，磁旋比高，沒(méi)有背景信號(hào)干擾，靈敏度高，使用氟原子代替氫原子不會(huì)明顯的影響分子的結(jié)構(gòu)，19F核的多種特性使其成為研究生物學(xué)過(guò)程的有力工具。核磁共振能研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，功能，底物結(jié)合，構(gòu)象變化等信息。本章第一部分總結(jié)了氟核應(yīng)用于核磁共振的優(yōu)勢(shì)，接下來(lái)介紹了氟標(biāo)記蛋白質(zhì)和多肽的合成原理和方法，最后重點(diǎn)介紹了結(jié)合19F NMR和氟標(biāo)記探針?lè)椒ㄔ诟黝I(lǐng)域中的應(yīng)用，包括研究蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)和功能、藥物的開(kāi)發(fā)和篩選、代謝過(guò)程、生物活性

4、分子體內(nèi)追蹤等信息。
　　第三章描述了應(yīng)用位點(diǎn)特異性19F標(biāo)記和19F NMR研究crude lysate蛋白質(zhì)間相互作用。我們成功的通過(guò)化學(xué)方法合成了非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸，并利用19FNMR分析兩個(gè)促分裂原激活蛋白激酶(MAPKs): MEKK3和MEK5的PB1結(jié)構(gòu)域在天然細(xì)胞環(huán)境下蛋白質(zhì)間的相互作用。高度保守的MAPKs家族是一個(gè)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要體系，其中比較重要的是參與從細(xì)胞膜到細(xì)胞核或細(xì)胞內(nèi)其它位置的信號(hào)傳遞。

5、MEKK3和MEK5在N端都含有一個(gè)PB1結(jié)構(gòu)域，它們通過(guò)形成二聚體發(fā)揮作用。我們將19F-tfmF分別插入到MEKK3-PB1和MEK5-PB1的不同位點(diǎn)，然后通過(guò)19F NMR化學(xué)位移變化和弛豫分析MEKK3-PB1和MEK5-PB1的相互作用界面，我們還證明了MEKK3-PB1和MEK5-PB1共純化樣品結(jié)合界面標(biāo)記位點(diǎn)的化學(xué)位移變化與在細(xì)菌濃漿樣品(crude lysate)樣品中的變化一致。
　　第四章介紹利用19F固體

6、核磁共振來(lái)研究蛋白質(zhì)的磷酸化信息，以及在苯乙烯馬來(lái)酸酐（styrene maleic anhydride，SMA）作用下形成的脂碟(lipodisq)對(duì)細(xì)胞膜環(huán)境的改變。我們證實(shí)了苯乙烯馬來(lái)酸酐包裹形成的單層囊膜脂碟在膜蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能研究中的優(yōu)勢(shì)。餅狀膠束(bicelles)和納米碟(nanodiscs)，雖然也可以提高底物與膜蛋白的接觸幾率，但或需要特殊脂質(zhì)，或需要去污劑參與，或由于膜支架蛋白的影響，使其都不是最佳的研究介質(zhì)。Li

7、podisq一方面能維持完整的細(xì)胞膜環(huán)境，另一方面還可以提高底物與膜蛋白的接觸幾率，為利用19F固體核磁共振方法或者其它生物物理方法研究天然細(xì)胞膜環(huán)境下配體受體結(jié)合，酶學(xué)分析，蛋白質(zhì)間相互作用提供了便利。
　　第五章主要介紹小分子熒光探針的發(fā)展以及在生物學(xué)中的應(yīng)用，結(jié)合非天然氨基酸標(biāo)記和小分子熒光探針L-(7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine熒光壽命等熒光特性研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。