19F定點標記及19F核磁共振方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學研究中的應用.pdf

1、在此論文中我們主要討論了應用非天然氨基酸標記和19F核磁共振相結(jié)合的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力學,論文共分為六個章節(jié)。
　　 第一章簡要概述了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和動力學之間的關(guān)系,以及用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和動力學的核磁共振方法。蛋白質(zhì)功能的多樣性與其空間結(jié)構(gòu)密不可分,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)的功能活性基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是內(nèi)部動態(tài)的過程,動力學特性對蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮具有重要作用。NMR方法可以在很寬的時間尺度上進行蛋白質(zhì)動力學的研

2、究。針對大分子量蛋白和信號靈敏度較低的情況下,可以采用固體核磁共振和位點特異性氨基酸標記的方法進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和動力學的研究。
　　 第二章介紹了用非天然氨基酸位點特異性標記的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力學。核磁共振能夠研究適當大小蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、配體結(jié)合、構(gòu)象變化等,研究更大的蛋白質(zhì)需要發(fā)展硬件以及同位素標記方法等。由于大分子量蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目較多,弛豫較快,線寬很寬,信號較弱,往往導致重疊的核磁譜峰難以進行歸屬。單氨基酸特

3、異性標記可以減少核磁譜峰的重疊,但是對于含有很多同種氨基酸的大蛋白還是解決不了問題。但是位點特異性非天然氨基酸標記只有一個核磁信號出現(xiàn),使得核磁信號的歸屬非常容易。本章介紹了目前用于核磁共振研究的非天然氨基酸的種類和標記方法,分別介紹了液體和固體核磁在非天然氨基酸標記研究中的應用。
　　 第三章描述了應用19F位點特異性氨基酸標記的方法對蛋白質(zhì)的動力學分析。我們成功的化學合成了主鏈和側(cè)鏈雙標記非天然氨基酸15N／l9FtfmF,

4、用一對正交的氨酰tRNA合成酶/tRNACUA實現(xiàn)了將雙標記非天然氨基酸插入到水溶性蛋白和膜蛋白的特異性位點。對人源Vinexin蛋白C末端第一個SH3domain進行了配體結(jié)合前后的動力學分析。將15N/19FtfmF標記在SH3結(jié)構(gòu)域的三個不同位點,得到了三個不同位點的主鏈和側(cè)鏈化學位移。對SH3在配體P868結(jié)合前后的主鏈(15N)1H、側(cè)鏈19F的化學位移和弛豫分析表明,三個不同位點在配基結(jié)合前后具有不同的內(nèi)部運動。接著我們用S

5、H3結(jié)構(gòu)域在60％甘油中的樣品模擬了大分子量蛋白的運動,對其一維19F譜和側(cè)鏈T1、T2進行了分析。另外,我們對膜蛋白DGAK三聚體在DPCmicell中的化學位移和側(cè)鏈弛豫分析表明,這種非天然氨基酸位點特異性標記的方法可以用于分析膜蛋白的側(cè)鏈內(nèi)部運動。
　　 第四章闡述了19F位點特異性氨基酸標記方法的其他應用。首先以膜蛋白DAGK為例,分析了19F位點特異性氨基酸標記在膜蛋白溶劑暴露中的研究,結(jié)果表明位于DAGK不同位置的氨

6、基酸殘基化學位移的變化是不同的,與已知三維結(jié)構(gòu)中殘基的位置分布一致。其次,應用位點特異性19F弛豫增強實驗(PRE)對一個多結(jié)構(gòu)域蛋白L27tan的兩種結(jié)構(gòu)構(gòu)象進行了辨認。通過檢測半胱氨酸上的自旋標記物MTSL和位點特異性標記的氨基酸t(yī)fmF之間的PRE效應,判斷兩個位點在空間結(jié)構(gòu)上的距離。結(jié)果表明,L27tan在溶液中采取關(guān)閉型的構(gòu)象。最后是對19F位點特異性標記膜蛋白DAGK的原位固體核磁共振研究。用原位MAS固體核磁共振的方法對D

7、AGK在天然膜環(huán)境中的化學位移和側(cè)鏈弛豫進行了分析。與DAGK/DPC樣品的液體核磁數(shù)據(jù)比較表明,位于膜蛋白不同位置的氨基酸殘基的化學位移和縱向弛豫受膜環(huán)境的影響不同。
　　 第五章主要概括了對BK鉀離子通道跨膜螺旋S0和S1之間loop(S0-S1loop)的液體核磁共振研究。BK鉀離子通道是一種大電導鉀離子通道,能夠被Ca2+、Mg2+和電壓所激活,在許多生理過程中發(fā)揮重要作用。與其他電壓門控鉀離子通道不同的是,BK鉀離子通

8、道具有7個跨膜螺旋和S0-S1loop,我們用液體核磁共振的方法對S0-S1loop的二級結(jié)構(gòu)和主鏈動力學進行了分析。Xplor-NIH結(jié)構(gòu)計算表明S0-S1loop中有兩個雙親的α螺旋,可能與細胞膜或者跨膜螺旋有相互作用。Mg2+滴定實驗結(jié)果表明,單獨的S0-S1loop存在時T45和L46有化學位移擾動而Mg2+結(jié)合位點D99卻沒有化學位移變化。
　　 第六章主要展望了如何利用19F非天然氨基酸標記的方法將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力