α-氨基腈類腈水合酶酶源的篩選及其在合成2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺中的應(yīng)用.pdf

1、微生物腈水合酶作為腈轉(zhuǎn)化酶家族的重要一員，能夠催化腈類化合物的水合反應(yīng)生成高附加值的酰胺，被廣泛應(yīng)用于制備醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體和精細(xì)化工產(chǎn)品等。2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺是廣譜、高效的咪唑啉酮除草劑合成的關(guān)鍵中間體。腈水合酶催化轉(zhuǎn)化2-氨基-2，3-二甲基丁腈制備2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺具有產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等特點(diǎn)，符合“綠色化學(xué)”的要求。本論文以該工藝路線為核心，從生物催化劑的發(fā)現(xiàn)、表征、制備與應(yīng)用，產(chǎn)物的分離、提純

2、等方面展開研究。
　　 本文首先創(chuàng)建了一個(gè)以α-氨基腈或α-氨基酰胺為底物的腈水合酶和酰胺酶高通量篩選模型。研究并提出了其顯色反應(yīng)的機(jī)理，是基于亞鐵離子和鐵離子與α-氨基腈溶液中的氰離子或α-氨基酰胺溶液中的氫氧根離子的反應(yīng)。通過該模型，從418株菌種中篩選到了3株能轉(zhuǎn)化2-氨基-2，3-二甲基丁腈生產(chǎn)2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的腈水合酶產(chǎn)生菌。其中兩株篩選自土壤樣品，編號(hào)ZA0707和P4；另外一株菌Rhodococcus

3、 boritolerans CCTCC M208108來自本實(shí)驗(yàn)室的微生物菌庫。該模型是第一個(gè)直接、快速的腈水合酶高通量篩選模型，同時(shí)也是第一個(gè)集腈水合酶和酰胺酶的篩選于一體的篩選模型。
　　 通過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、API自動(dòng)鑒定系統(tǒng)、16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株ZA0707被鑒定為慶笙紅球菌(Rhodococcusqingshengii)。這是該種內(nèi)首次報(bào)道的產(chǎn)腈水合酶的菌株。進(jìn)而研究并對(duì)比了菌株ZA0707和

4、R.boritolerans CCTCC M208108胞內(nèi)腈水合酶的氰離子耐受性、產(chǎn)物耐受性、熱穩(wěn)定性和對(duì)2-氨基2，3-二甲基丁腈活力等方面的特性，優(yōu)選R.boritolerans CCTCC M208108作為酶法轉(zhuǎn)化2-氨基2，3-二甲基丁腈制備2-氨基2，3-二甲基丁酰胺的生物催化劑并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)R.boritolerans CCTCC M208108產(chǎn)腈水合酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化

5、。確定了較佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分為(g/l)：蔗糖7.00，檸檬酸鈉3.04，牛肉膏5.13，酵母粉5.00，己內(nèi)酰胺1.50，KH2PO41.0，K2HPO41.0，NaCl1.0，F(xiàn)eCl30.005，CoCl20.005，MnSO40.005。隨后研究并選定了較適宜的培養(yǎng)條件為：初始pH6.5，30℃，裝液量40 ml/250 ml，接種量1.5 ml。在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60 h后，生物量達(dá)到6.21g/l，腈水合酶的活力達(dá)到539

6、3 U/g CDW。
　　 論文還研究了酶催化反應(yīng)的環(huán)境和介質(zhì)對(duì)該腈水合酶活力的影響。結(jié)果表明，最適宜的緩沖液體系是Tris-HCl溶液，pH8.9；最高酶活出現(xiàn)在30-35℃范圍內(nèi)；向反應(yīng)體系中添加30％(v/v)正己烷和1mM Ni2+，酶活力可分別提高30％和23％。對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)的Vmax和Km分別為：15.73μmol·min-1·mg-1和44.30 mM。發(fā)現(xiàn)了降低溫度可以使2-氨基-2，3-

7、二甲基丁腈溶液更加穩(wěn)定，特別是在10℃，由底物自發(fā)解離產(chǎn)生的氰離子濃度僅為2.01 mM，不足30℃下的四分之一。在深入了解影響反應(yīng)的主要因素以后，放大反應(yīng)體系至800 ml，建立了水相和以正己烷為共溶劑的兩相反應(yīng)體系；對(duì)關(guān)鍵的反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化后，有效地減輕了氰離子和底物對(duì)腈水合酶的抑制，使得產(chǎn)物濃度、產(chǎn)率和催化劑生產(chǎn)力分別達(dá)到50g/l、91％和6.3 gproduct/g catalyst。在優(yōu)化條件下，菌體至少可以重復(fù)利用兩次，使得催

8、化劑生產(chǎn)力進(jìn)一步提高到12.3 g product/g catalyst。
　　 論文隨后選用膨脹型珍珠巖作為固定化的載體，采用吸附培養(yǎng)法固定R.boritolerans CCTCC M208108細(xì)胞，以提高細(xì)胞的氰離子耐受性和重復(fù)使用性能。從提高酶活的角度，優(yōu)化珍珠巖吸附固定化細(xì)胞的制備條件，確定較佳條件為：初始培養(yǎng)pH值7.0，固定化培養(yǎng)溫度30℃，載體用量40 ml(培養(yǎng)基用量40 ml，250 ml三角瓶)，最佳培養(yǎng)時(shí)

9、間54 h。在此條件下，固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞相比氰離子耐受性和重復(fù)使用次數(shù)分別提高了16％和3批次。這是有關(guān)珍珠巖用于固定化腈水合酶或其產(chǎn)生菌的首次報(bào)道。研究了固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-氨基-2，3-二甲基丁腈的動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Vmax-固=13.59μmol·min-1·mg-1，Km-固=47.98 mM；并求得固定化細(xì)胞催化反應(yīng)的達(dá)姆科勒數(shù)，Da=4.9×104。固定化細(xì)胞的Km-固值大于游離細(xì)胞的Km值，而且Da遠(yuǎn)大于1，說明外部傳質(zhì)阻力(

10、底物從主體溶液到固定化載體上的細(xì)胞表面所受的阻力)影響了固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-氨基-2，3-二甲基丁腈，并且可能成為反應(yīng)的限速因素。
　　 論文最后開發(fā)了一個(gè)從反應(yīng)體系中分離、純化產(chǎn)物2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的新方法。利用離心、活性炭吸附除雜、減壓蒸餾、乙酸乙酯/正己烷重結(jié)晶等分離手段對(duì)酶催化反應(yīng)體系中的重結(jié)晶產(chǎn)物進(jìn)行了有效分離、提純(純度達(dá)98.5％)。并通過FT-IR、1H NMR和13C NMR等分析方法對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了