腈水合酶基因資源開發(fā)及其重組表達(dá)體系在制備煙酰胺中的應(yīng)用.pdf

1、在化學(xué)合成制藥工業(yè)中，由腈化合物發(fā)生水合反應(yīng)生產(chǎn)相應(yīng)的酰胺是一類重要的化學(xué)反應(yīng)。然而，化學(xué)合成法必需苛刻的反應(yīng)條件，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高溫等。與此相比，生物轉(zhuǎn)化法體現(xiàn)出化學(xué)法無法比擬的優(yōu)勢，不僅反應(yīng)高效專一，反應(yīng)條件溫和，而且具有獨(dú)特的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性的特點(diǎn)。在生物催化過程中，篩選高效的生物催化劑是其技術(shù)核心。腈水合酶(EC4.2.1.84)是微生物降解腈化合物的雙酶途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化水合反應(yīng)生成高附加值的酰胺化合物

2、，從而被廣泛地應(yīng)用于制備醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體等精細(xì)化工產(chǎn)品等。目前，采用腈水合酶生物法生產(chǎn)酰胺化合物基本上都是采用野生菌細(xì)胞。然而，由于在同一基因簇中也存在著酰胺酶基因，因此酰胺易被進(jìn)一步水解為羧酸，不僅降低產(chǎn)品的得率，而且影響整個(gè)純化過程工藝。本論文試圖采用基因組探礦技術(shù)篩選新型的腈水合酶基因，并在E.coli細(xì)胞中構(gòu)建重組表達(dá)體系，探索一種可替代的微生物法制備高質(zhì)量酰胺化合物的生產(chǎn)策略。
　　目前已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證明其功能的腈水合酶基

3、因的數(shù)目較少，據(jù)我們所知不超過40種，而且基因來源比較單一。尤其是鐵型腈水合酶，除了一例Pseudomonaschlororaphis B23腈水合酶外，其它均來源于紅平紅球菌Rhodococcus erythropolis，后者的蛋白質(zhì)序列同源度非常高，一致度大于95％。因此，我們首先構(gòu)建一種基于蛋白質(zhì)保守片段搜索的腈水合酶基因探礦策略。采用此方法，從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索到大量的假定腈水合酶基因，都來源于已完成測序計(jì)劃的微生物基

4、因組中，具有完整的基因數(shù)據(jù)信息。從挖掘的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，可用的鐵型腈水合酶基因的數(shù)目在數(shù)據(jù)庫中相對(duì)較少，僅僅搜索到20種假定的基因，蛋白質(zhì)序列的同源度分布在45～99％之間?；騺碓闯顺Ｒ姷募t球菌屬Rhodococcus，假單胞菌屬Pseudomonas是另外一大類，另外還有伯氏菌屬Burkholderia、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、貪食菌屬Variovorax、食酸菌屬Acidovorax等微生物中。而對(duì)于鈷型腈水合酶，在數(shù)

5、據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)大量的基因數(shù)據(jù)信息，本文僅篩選了其中的56種假定鈷型腈水合酶基因，分別來源于不同的微生物，包括紅球菌屬Rhodococcus、鏈霉菌屬Streptomyces芽孢桿菌屬Bacillus，假諾卡氏菌屬Pseudonocardia、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium等。
　　針對(duì)鐵型腈水合酶的研究，我們克隆和表達(dá)了來源于Pseudomonas putidaF1的腈水合酶基因，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的表征。NHase F

6、1的蛋白質(zhì)序列與Rhodococcus erythropolis腈水合酶同源度較低，相似度＜60％。同時(shí)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，毗鄰于β-亞基下游的Pput_2730基因?qū)Hase_F1在E.coli細(xì)胞中的功能表達(dá)非常關(guān)鍵。只有在腈水合酶基因和Pput_2730基因共表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物才以可溶蛋白的形式存在，而且表現(xiàn)出腈水合酶的活力。因此，結(jié)果建議Pput_2730基因作為腈水合酶的活化元件，直接關(guān)系到NHase_F1在E.coli細(xì)胞中的活性表

7、達(dá)，其部分功能可能參與了蛋白質(zhì)的正確折疊。與其它大多數(shù)鐵型腈水合酶比較，NHase_F1表現(xiàn)出更寬的底物譜，包括脂肪族、芳香族腈化合物。尤其，NHase_F1可以催化3-氰基吡啶生產(chǎn)煙酰胺。因此，重組NHase_F1在某些重要酰胺化合物的制備中具有很高的應(yīng)用潛力。
　　一般情況下，鈷型腈水合酶表現(xiàn)出更寬的底物譜，尤其是針對(duì)芳香族腈化合物。因此，我們克隆和表達(dá)了6種不同來源的腈水合酶，分別來源于Silicibacterpomeroy

8、i DSS-3,Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1, Bradyrhizobiumjaponicum USDA110,Pseudomonas putida5B,Mesorhizobium loti JCM21590和Sinorhizobium meliloti NRRL L-45，都具有水合3-氰基吡啶生產(chǎn)煙酰胺的活力。再通過比較，A.manganoxydans SI85-9A1腈水合酶具有更高的3-

9、氰基吡啶水和活力，命名為NHase_08，作為后續(xù)工作的研究重點(diǎn)。另外，雖然NHase_08屬于鈷型腈水合酶家族，然而其結(jié)構(gòu)基因順序?yàn)?α-β-，不同于大多數(shù)已報(bào)道的鈷型腈水合酶基因順序:-β-α-。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與β亞基下游毗鄰的一段假定基因，SI859A1_00581，對(duì)NHase_08的功能表達(dá)具有決定性的作用，但是不影響蛋白的可溶性表達(dá)。值得關(guān)注的是，重組NHase_08表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為50℃。而且，在不加任何保

10、護(hù)劑的條件下，50℃時(shí)半衰期達(dá)到1.5 h。為了實(shí)現(xiàn)重組NHase_08的規(guī)?；苽洌覀冊O(shè)計(jì)和優(yōu)化了一種適合工業(yè)化應(yīng)用的自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，AIM，不僅生產(chǎn)成本大幅度降低，而且NHase_08的表達(dá)水平與傳統(tǒng)IPTG誘導(dǎo)結(jié)果基本相當(dāng)。采用AIM培養(yǎng)基，在10-L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵中，最終菌體密度達(dá)到39.5 g/L(干重)，腈水合酶活力為2170 U/ml培養(yǎng)液，目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平＞25％。
　　煙酰胺屬于B族維生素，是生物體內(nèi)輔酶

11、Ⅰ或Ⅱ的組成部分，可以作為膳食，以及動(dòng)物飼料的添加劑，具有廣泛的應(yīng)用和市場前景。重組NHase_F1和NHase_08都能轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶生產(chǎn)煙酰胺。以3-氰基吡啶為底物，純化后重組NHase_F1的比活為26.6 U/mg蛋白，而NHase_08比活為404.5 U/mg蛋白。在1L的分批補(bǔ)料反應(yīng)中，采用重組NHase_08全細(xì)胞催化，5h完全轉(zhuǎn)化了3.6摩爾3-氰基吡啶為煙酰胺，幾乎沒有任何副產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，鑒于重組NHase_0