匯利心康對心肌纖維化的影響及其與miR-199關(guān)系的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是指心肌組織中膠原纖維過量堆積，膠原蛋白含量明顯升高或膠原蛋白成分發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為心肌成纖維細胞增殖并分泌大量膠原蛋白。心肌纖維化是多種心臟血管疾病的共同病理改變，是心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，可導致心室舒張功能異常、心臟電生理紊亂、心律失常，終末期可因冠狀動脈儲備顯著下降而導致猝死。近年來，減緩或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為當前治療高血壓及慢性充血性心力衰竭的重

2、要目標之一。目前，心肌纖維化的發(fā)病機制尚不清楚，其特異性防治藥物也亟待進一步發(fā)展。
　　小RNA(microRNAs，miRNAs)是一段22～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA，它通過與下游靶基因的3'非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)發(fā)生特異性結(jié)合，參與細胞的生長，屬轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。已有研究提示一些miRNAs在心臟重構(gòu)中表達異常，但miRNAs在心肌纖維化過程中的表達變化規(guī)律及作用機制尚待進一步研究。

3、　　在心肌纖維化等心臟重構(gòu)過程中，鳥苷酸結(jié)合蛋白Gq處于核心地位，多種導致心臟重構(gòu)的主要信號通路都通過與Gq蛋白相偶聯(lián)而激活下游信號。十余年來，本實驗室研究開發(fā)了Gq蛋白α亞單位羧基末端模擬肽匯利心康(HLXK)，已在多種動物和細胞模型中證實，具有良好的抗心肌肥大作用。本研究擬在我們預實驗工作的基礎(chǔ)上，開展HLXK防治心肌纖維化與miRNA的關(guān)系研究，旨在為深化對HLXK防治心肌纖維化機制的認識和尋找新的有效分子靶標提供實驗基礎(chǔ)。

4、>　　方法:
　　1.雄性SPF級昆明小鼠，采用去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE1.5mg/kg）制備心肌纖維化模型，連續(xù)20天;用5mg/kg的氯沙坦作為陽性對照;HLXK組在給予去甲腎上腺素的同時給予HLXK(30μg/kg，90μg/kg)。給藥后第21天，處死小鼠，稱量并計算左心室質(zhì)量指數(shù);每組取6只小鼠的左心室組織，置于4％多聚甲醛中固定2天后，苦味酸-天狼星紅染色，觀察小鼠左心室心肌組織膠原纖維變化;每

5、組取6只小鼠左心室組織，精確稱取濕重后，試劑盒檢測小鼠左心室組織羥脯氨酸含量。HE染色觀察小鼠左心室心肌組織形態(tài)學變化。采用RT-qPCR方法，檢測小鼠左心室組織miRNA表達變化。
　　2.離體培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細胞中，給予終濃度為1×10-7mol/L的AngⅡ造模，并檢測HLXK對AngⅡ誘導的心臟成纖維細胞中miRNA的表達變化的影響，分別觀察HLXK和miR-199對成纖維細胞膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ基因和蛋白表達水平的影響，轉(zhuǎn)染

6、miR-199 inhibitor或者mimic，觀察miR-199對心臟成纖維細胞中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ基因和蛋白表達變化的影響。
　　3.離體培養(yǎng)大鼠心肌細胞，給予終濃度為1×10-6mol/L的NE造模，檢測HLXK對NE誘導的離體培養(yǎng)的心肌細胞miRNA表達變化的影響，分別觀察HLXK和miR-199對心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入量的影響，轉(zhuǎn)染miR-199 inhibitor或者mimic，觀察miR-199對心肌細胞[3H]

7、-亮氨酸摻入量的影響。
　　結(jié)果:
　　1.造模第21天，模型組LVMI顯著高于對照組;與模型組相比，90μg/kg HLXK可顯著降低模型組LVMI?？辔端?天狼猩紅染色發(fā)現(xiàn)，模型組心肌組織膠原纖維沉積顯著增加(P＜0.01)，HLXK組的膠原纖維沉積較模型組明顯減少(P＜0.01);模型組小鼠左心室組織羥脯氨酸含量顯著增加了24.66％，90μg/kg HLXK可顯著減少羥脯氨酸含量（P＜0.01）。體外試驗發(fā)現(xiàn)，與An

8、gⅡ模型組相比，30及90μg/kg HLXK均可顯著降低膠原蛋白Ⅰ基因和蛋白表達量(P＜0.01)，但對膠原蛋白Ⅲ基因和蛋白表達無明顯影響。HE染色表明，HLXK組心肌細胞排列基本整齊，心肌細胞纖維化明顯減輕，未見明顯的炎細胞浸潤。在該動物模型中，模型組左心室中miR-199、miR-499和miRNA-1-2-5p的表達顯著增高，分別升高了731％、148％、242％;在給予HLXK防治心臟肥大的同時，也可明顯抑制miRNA表達增加

9、(P＜0.01)。
　　2.在培養(yǎng)的離體心臟成纖維細胞中，給予終濃度1×10-7 mol/L AngⅡ造?？娠@著上調(diào)心臟成纖維細胞miR-199的含量(P＜0.01);同時給予HLXK11.3 mg/L可顯著抑制miR-199的基因和蛋白表達(P＜0.01)。miR-199 inhibitor可顯著減少膠原蛋白Ⅰ基因和蛋白表達(P＜0.01)，僅轉(zhuǎn)染miR-199 mimic即可顯著增加114.80％膠原蛋白Ⅰ的表達(P＜0.01

10、)，而miR-199 inhibitor對膠原蛋白Ⅲ基因和蛋白表達量影響不明顯。
　　3.在培養(yǎng)的離體乳鼠心肌細胞中，終濃度1×10-6mol/L NE可顯著增加心肌細胞[3H]-亮氨酸摻入，HLXK可顯著降低NE導致的[3H]-亮氨酸摻入量30.5％，還可顯著抑制NE升高的miR-499、miR-1-2-5p和miR-199的表達。30nmol/L miR-199 inhibitor可顯著減少NE導致的心肌細胞[3H]-亮氨酸摻