反式茴腦微生物降解和轉化合成茴香醛和茴香酸.pdf

1、八角是廣西盛產(chǎn)的天然香料資源,八角茴香油(簡稱茴油)是從八角果、枝和葉中提取的一種芳香精油,其中反式茴腦含量為80％～90％。反式茴腦是具有丙烯基苯結構的化合物,通常作為化學法合成香料的起始原料。微生物在降解丙烯基苯化合物的過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物大部分都是具有很高經(jīng)濟價值的芳香族化合物。利用微生物轉化反式茴腦極有可能獲得茴香醛、茴香酸等高附加值的天然生物香料。因此本課題選擇反式茴腦為底物,篩選能降解并轉化反式茴腦合成茴香醛或茴香酸的微生物

2、;同時對影響轉化的因素、生物降解中間產(chǎn)物的分離鑒定以及反式茴腦的生物降解途徑進行了探討。
　　 一、反式茴腦生物降解和轉化體系的分析方法建立
　　 建立了分析反式茴腦降解和轉化體系中反式茴腦和產(chǎn)物茴香醛、茴香酸的薄層層析法(TLC法)、薄層層析-紫外分光光度法(TLC-UV法)、反相高效液相色譜法(RP-HPLC法)和硫代巴比妥酸分光光度法(TBA法)。TLC法選用的適宜展開劑配方為石油醚(bp.60℃～90℃):氯仿:

3、乙酸乙酯:甲酸(V/V/V/V):25:10:3:0.2,該法能同時定性和半定量分析反式茴腦、茴香醛和茴香酸,操作簡單,檢測快速,適合于生物降解和轉化反式茴腦菌株的快速篩選。TLC-UV法和RP-HPLC法可同時定量分析反式茴腦、茴香醛和茴香酸三元混合體系,RP-HPLC法測定的準確性高于TLC-UV法。適宜的RP-HPLC法條件為:采用Kromasil-100AC18色譜柱(250mm×4.6mm×5μm),流動相為V(乙腈):V(水

4、):V(冰醋酸)=70:30:0.02,等度洗脫,流速0.8mL·min-1,檢測波長為260nm,進樣量5μL,柱溫室溫。此外,還可根據(jù)需要采用硫代巴比妥酸分光光度法定量測定樣液中的茴香醛,反式茴腦和茴香酸對茴香醛的測定幾乎沒有影響。
　　 二、生物降解反式茴腦的微生物篩選及鑒定
　　 通過從廣西高峰林場八角種植區(qū)土樣、八角植物內生菌、八角加工車間廢液中篩選耐受高濃度茴油的微生物,并檢驗菌株降解反式茴腦合成茴香醛或茴香

5、酸的能力。用逐級添加茴油的富集培養(yǎng)方法從土樣中獲得了一株能夠在1％(V/V)茴油濃度下生長的菌株BT-13,確定其在改良M9培養(yǎng)基上,一定的轉化條件下,具有高轉化反式茴腦的能力,轉化產(chǎn)物以茴香酸為主。菌株BT-13根據(jù)其形態(tài)特征觀察、部分生理生化特性和16SrDNA序列同源性比較,鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。從新鮮八角果、枝、葉中分離到87株內生菌,其中真菌69株,細菌18株。有一株內生細菌BZ-15對反式茴腦降解

6、能力較強,可檢測到茴香酸的生成。該菌經(jīng)16SrDNA序列同源性比較,鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。從八角加工車間廢液中篩選獲得了一株具有較強降解反式茴腦能力并轉化合成少量茴香醛的真菌菌株ZJ-9,通過對其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征的觀察,對照《真菌鑒定手冊》,鑒定該真菌為黑曲霉。
　　 三、微生物轉化反式茴腦合成茴香醛和茴香酸工藝研究
　　 研究了假單胞菌BT-13在有機溶劑-水兩相體系中生物轉化反式

7、茴腦合成茴香醛的條件。首先考察了在搖瓶條件下,有機溶劑極性和加入量、培養(yǎng)基配方、轉化時間、轉化溫度、搖床轉速、裝液量以及pH值等條件對游離細胞轉化合成茴香醛的影響。結果表明,適宜有機溶劑為乙酸乙酯,加入量控制在10％(V/V)。適宜的培養(yǎng)基為改良馬丁氏培養(yǎng)基,培養(yǎng)方式為搖床培養(yǎng)。在裝液量為20mL/150mL三角瓶,培養(yǎng)基初始pH控制在6.5,溫度30℃,轉速150r·min-1,轉化時間30h,茴香醛的摩爾生成率為7.7％。接著在此兩

8、相體系中采用海藻酸鈣固定化細胞對反式茴腦進行轉化,茴香醛的摩爾生成率可提高至12.6％。為實現(xiàn)轉化液中未轉化的反式茴腦和茴香醛的分離,轉化液首先用等體積的乙酸乙酯萃取,取上層有機相,接著在有機相中加入飽和亞硫酸氫鈉將茴香醛反萃到水相,再將水相茴香醛加成物酸化成醛的形式,最后用乙酸乙酯萃取可得到茴香醛。
　　 開展了假單胞菌BT-13在改良M9培養(yǎng)基上轉化反式茴腦合成茴香酸的條件優(yōu)化,考察了培養(yǎng)基配方、底物加入量、搖床轉速、溫度和

9、培養(yǎng)基初始pH值對茴香酸生成的影響。結果表明:在改良M9培養(yǎng)基中添加碳源的濃度高于1g·L-1時,明顯抑制反式茴腦的轉化。生成茴香酸的優(yōu)化條件是,培養(yǎng)基配方為麥芽糖0.5g·L-1,NH4Cl0.5g·L-1,FeSO4·7H2O0.01g·L-1,MgSO4·7H2O2.0g·L-1,NaCl0.5g·L-1,Na2HPO46.8g·L-1,KH2PO43.0g·L-1,CaCl20.02g·L-1;反式茴腦加入量為9.83g·L-1

10、,搖床轉速為200r·min-1,轉化溫度為30℃,轉化培養(yǎng)基的初始pH為7.0。在優(yōu)化條件下,茴香酸積累的濃度為3.49g·L-1,摩爾生成率為34.6％,比優(yōu)化前結果提高了92.8％。假單胞菌BT-13轉化反式茴腦的主要產(chǎn)物為茴香酸,還含有茴香醛、茴香二醇等中間產(chǎn)物。利用5L機械攪拌發(fā)酵罐進行放大試驗,茴香酸濃度最高可達3.57g·L-1,摩爾生成率為36.1％。轉化液經(jīng)酸化、乙酸乙酯萃取、真空濃縮和結晶可得到針狀的茴香酸晶體。

11、r>　　 四、反式茴腦在假單胞茵B(yǎng)T-13和黑曲霉ZJ-9作用下的可能降解途徑
　　 采用高效液相色譜和氣相色譜/質譜聯(lián)用等手段分析假單胞菌BT-13和黑曲霉ZJ-9降解反式茴腦的中間產(chǎn)物,通過與標準物質的比對或GC-MS圖譜分析確定了假單胞菌BT-13降解反式茴腦四種中間產(chǎn)物,分別為茴香環(huán)氧化物、茴香二醇、茴香醛和茴香酸;黑曲霉ZJ-9降解反式茴腦五種中間產(chǎn)物,分別為茴香環(huán)氧化物、茴香二醇、茴香醇、茴香醛和茴香酸,且在一定條

12、件下,茴香醇有一定程度的積累。這些中間產(chǎn)物中茴香醇、茴香醛和茴香酸在香料和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中是高附加值的芳香族化合物。根據(jù)中間產(chǎn)物的生成情況,推測了這兩種菌降解反式茴腦的可能途徑。假單胞菌BT-13和黑曲霉ZJ-9降解反式茴腦的共同可能途徑:反式茴腦首先在丙烯基側鏈雙鍵處加氧,形成茴香環(huán)氧化物,環(huán)氧化物水解后形成茴香二醇,進一步氧化生成茴香醛、茴香酸。在黑曲霉ZJ-9中,茴香醛還可以被還原生成茴香醇。兩種菌都通過形成茴香二醇途徑實現(xiàn)對反式茴腦的

13、降解,但在某些中間產(chǎn)物積累上存在差異。
　　 假單胞菌BT-13和黑曲霉ZJ-9胞內酶中檢測到過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性。假單胞菌BT-13胞內檢測的POD和CAT酶活最高分別為122U·mL-1和625U·mL-1,黑曲霉ZJ-9胞內檢測的POD和CAT酶活最高分別為4.8U·mL-1和42.5U·mL-1,明顯低于假單胞菌BT-13。從檢測的酶活結果和兩株菌降解反式茴腦中間產(chǎn)物的積累情況,得出黑曲霉ZJ