磷酸酶與生物小分子檢測的非標記熒光傳感新方法研究.pdf

1、堿性磷酸酶(ALP)是一種能夠從多種生物分子如核酸，蛋白質(zhì)，生物堿等中去除其磷酸基團的水解酶。ALP的催化反應能將DNA末端的磷酸基團修復成羥基。ALP在基因轉(zhuǎn)導，細胞代謝以及神經(jīng)元作用等許多生物進程中扮演了重要的作用。三磷酸腺苷(ATP)是生物體中的重要基質(zhì)，是體內(nèi)組織細胞一切生命活動所需能量的直接來源，被譽為細胞內(nèi)能量的“分子貨幣”。ATP在細胞新陳代謝和生化過程的調(diào)控中扮演了重要的角色。因此，研究高靈敏和高選擇性的ALP和ATP的

2、檢測方法對于生化分析和臨床診斷非常重要。
　　 非標記檢測法由于具有快速簡便成本低的特點而備受關注。SYBR GreenⅠ(SG)是最常用的一種DNA嵌入染料，具有良好的光物理性質(zhì)、熱穩(wěn)定性以及高靈敏度，被廣泛用于分子檢測。但該方法存在非特異性吸附導致的高背景的缺陷，因而降低了信背比和靈敏度。
　　 目前，基于氧化石墨烯(GO)的傳感平臺已經(jīng)廣泛應用于一系列的分析物檢測。這歸因于GO獨特的吸附DNA以及很強的淬滅熒光的能

3、力。有關文獻報道了GO作為有效的信背比增強劑用于非標記分析檢測中。
　　 綜上所述，在查閱已有的文獻基礎上，本文構建了一系列新型的非標記熒光生物傳感器用于檢測磷酸酶和生物小分子。具體的工作內(nèi)容如下:
　　 在第二章中，發(fā)展了一種非標記、簡單、信號增強型，利用SYBR GreenⅠ(SG)輔助信號放大的熒光生物傳感器用于檢測堿性磷酸酶(ALP)。該策略基于ALP將磷酸化的DNA去磷酸化為羥基從而阻礙λ外切酶（λexo）的作

4、用，熒光染料SG與單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)結合作用的差異的原理，實現(xiàn)熒光檢測。我們的方法簡單、靈敏度高、選擇性好，并且能夠成功地用于分析復雜生物樣本中的目標物。分析結果表明該方法可以對目標物ALP進行特異性定量分析，線性范圍是0.4-200 U/mL，檢測限是0.05 U/mL。
　　 在第三章中，發(fā)展了一種基于發(fā)夾引物和聚合酶延伸的氧化石墨烯(GO)傳感新平臺檢測DNA3'磷酸酶。我們設計了一條3'磷

5、酸化的發(fā)夾引物(HP)作為DNA3'磷酸酶的底物鏈。當DNA3'磷酸酶將磷酸基團水解為羥基，去磷酸化的HP在Klenow片段聚合酶(KF polymerase)的作用下發(fā)生聚合延伸，形成很長的雙鏈產(chǎn)物。熒光染料SG會選擇性嵌入雙鏈DNA中，產(chǎn)生很強的熒光。此外，GO對沒有發(fā)生聚合延伸的HP的熒光有很強的淬滅作用，因此可以進一步提升信背比。此設計方法簡單便捷的同時具有很高的靈敏度以及很好的選擇性。該方法成功用于檢測兩種DNA3'磷酸酶—T

6、4多核苷酸磷酸酶(PNKP)和小蝦堿性磷酸酶(SAP)的活性。我們還研究了抑制劑對這兩種酶的抑制作用。分析結果表明該方法可以對T4 PNKP和SAP進行高靈敏定量分析，檢測限分別是0.07 U/mL和0.003 U/mL，為應用到DNA損傷修復機制的研究提供了可觀的前景。
　　 在第四章中，發(fā)展了一種基于連接反應和氧化石墨烯與ExoⅢ輔助的，SG作為熒光輸出信號的非標記熒光分析方法來檢測ATP。該方法依據(jù)核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)