酶比活導向的新型高效安培酶電極研究.pdf

1、酶是生物體內活細胞產生的高效高特異性生物催化劑，在生命活動中發(fā)揮著無可替代的重要作用。酶傳感器以酶為分子識別元件，具有選擇性好和靈敏度高等諸多優(yōu)點。自Clark和Lyons于1962年首次提出酶傳感器以來，隨著生物、化學、物理學、醫(yī)學和電子技術等相關學科的迅速發(fā)展，酶傳感器憑借其具有其它生物傳感器所無法比擬的優(yōu)勢而發(fā)展成為分析化學學科中最為活躍的研究領域之一。顯然，對固定化酶進行酶活性分析和檢測是評估酶固定方法優(yōu)劣、優(yōu)化酶固定材料和構建

2、新型高效酶生物傳感器的重要手段和主要依據。本學位論文中，我們簡要綜述了壓電傳感技術、安培酶電極和酶活性分析的近期進展，基于固定化酶生物活性測試和酶固定材料和方法的優(yōu)化開展了以下研究工作：
　　 (1)考察了電化學或化學預氧化兒茶酚胺(CA)在普魯士藍(PB)修飾電極上的電聚合，籍此高效包埋固定葡萄糖氧化酶(GOx)、實現了對葡萄糖的靈敏安培生物傳感。所涉及的CA包括多巴胺(DA)、L-去甲腎上腺素(NA)和腎上腺素(EP)，詳細

3、研究了以DA為單體的預氧化-電聚合固定酶法所構建的傳感器的性能。利用電化學石英晶體微天平(EQCM)監(jiān)測了電極修飾過程，并對幾種化學預氧化劑和陽極電化學預氧化電位進行了篩選和優(yōu)化。與常規(guī)電聚合法相比，預氧化步驟明顯提高了所得傳感器性能。在優(yōu)化條件下所得傳感器對葡萄糖的檢測下限(LOD)為0.30μM，靈敏度為35μAmM-1 cm-2，穩(wěn)定性和抗干擾性好，且在-0.05 V檢測電位下亦有優(yōu)良分析性能。紫外可見光譜法和EQCM法檢測結果證

4、實所固定的GOx酶比活性(ESA)高，基于NA聚合物的酶膜性能與DA聚合膜的基本相當，但EP聚合低效且其酶膜的生物傳感性能差。
　　 (2)K3Fe(CN)6快速化學氧化DA和NA產生相應的化學氧化聚合物(PDAc和PNAc)并同時有效包埋GOx。將該酶-高分子復合物滴干于金電極表面，并用殼聚糖(CS)進一步固定構建了高性能生物傳感器和生物燃料電池(BFC)。所得CS/PDAc-GOx/Au酶電極對葡萄糖靈敏度高(135μA m

5、M-1cm-2)、LOD低(0.07μM)、響應時間短(小于3 s)、抗干擾能力好。而且，該傳感器熱穩(wěn)定性良好，在30℃下使用壽命達兩個月，在60℃下壽命為三周。此外，該傳感器在以苯醌(BQ)或二茂鐵甲酸(Fc)為電子媒介體的第二代傳感模式下亦具有良好的分析性能，BQ和Fc的使用極大地拓寬了該傳感器的線性范圍(對BQ為2.0μM～48.0 mM，對Fc為2.0μM～16.0mM)并顯著提高了葡萄糖飽和電流密度(高達8.0 mA cm-2

6、)。利用這些人工電子媒介體在酶膜中良好的滲透性，我們根據已有動力學模型對所固定的GOx及其酶活進行了定量分析，結果表明CS/PDAc-GOx/Au電極上實現了酶的高負載量、高活性固定。同時，CS/PDAc-GOx/Au作為生物陽極構建的BFC最大功率密度達1.62 mW cm-2，優(yōu)于目前所報道的大多數BFC。
　　 (3)結合DA易吸附易聚合的性質和多壁碳納米管(MWCNTs)的高導電性，以GOx為模型酶，在磷酸緩沖液(PBS

7、)中合成DA-MWCNTs-GOx復合物并通過過量DA的電化學氧化聚合實現了GOx在石英晶體微天平(QCM)金電極表面的高效固定。結果表明，導電納米材料MWCNTs的引入改善了DA單體在電極表面的電沉積，實現了酶的高效包埋。同時，不導電聚多巴胺膜(PDA)賦予了該傳感器優(yōu)良的抗干擾能力。所制備的PDA-MWCNTs-GOx/Au酶電極對葡萄糖的檢測靈敏度高(60±3.2μAmM-1 cm-2)、LOD低(0.20μM)、線性范圍寬且抗干

8、擾能力強。
　　 (4)活性蛋白(如酶)在界面的吸附在科研、工業(yè)和醫(yī)學等領域具有廣泛意義。吸附酶的構象和取向將顯著影響吸附酶性能。因此，通過控制吸附條件實現對吸附酶性能的有效調控在眾多領域都具有重要應用價值。本章采用EQCM和紫外可見光譜法研究了GOx在裸金電極和多種短鏈巰基化合物(R-CH2-SH，R=-CH3，-CH2OH，-COOH或-CH2NH2)修飾金電極上的吸附，同時對所得吸附酶的酶活性及酶與電極間的直接電子傳遞進行

9、了研究。實驗結果表明通過增大吸附液中離子強度和適當降低酶濃度能顯著改善吸附酶的活性。優(yōu)化條件下，在電極表面可吸附固定同時具有高酶活性和高電活性的酶。
　　 (5)重金屬(HM)離子與酶的相互作用是許多領域的重要研究課題。本章以GOx為例，提出了一種基于QCM和電化學分析技術的綜合實驗平臺，用于研究HM離子與酶的相互作用并對HM離子進行了安培抑制分析。通過陽極安培檢測酶生H2O2，研究了HM離子對溶液態(tài)GOx(GOxs)、吸附態(tài)G

10、Ox(GOxads)和聚合物包埋的GOx(GOxe)的酶活性的抑制效果。在所考察的多HM離子中，Ag+對GOxs、GOxads和NA聚合膜(PNA)包埋的GOxe(GOxe-PNA)表現出最強的抑制效果，檢測下限分別為2.0、8.0和5.0nM。Hg2+、Cu2+和Co2+均需達到15μM以上濃度才開始抑制GOx活性，且濃度高達1.0 mM的Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+和As3+對GOx活性亦無明

11、顯抑制作用。基于該實驗平臺，我們檢測并首次報道了GOxads酶活的抑制百分率與一個GOxads分子上結合多少個HM離子的對應關系。此外，與其它幾種用于酶包埋和酶抑制分析的聚合物相比，PNA對HM離子親和力小，且對Ag+抑制分析具有最高靈敏度和最小干擾。該實驗平臺有望很好地用于很多氧化還原事件相關酶的抑制分析及其HM離子抑制效應的定量研究。
　　 (6)利用有機磷農藥對乙酰膽堿酯酶(AChE)的選擇性抑制，進行有機磷的快速高敏檢測

12、頗具意義。本章中，我們提出了一種利用溶液態(tài)AChE(AChEs)和吸附態(tài)AChE(AChEads)快速檢測對氧磷(PO)的新方法，并結合QCM與電化學方法對AChE酶活性進行了定量測試?？疾炝宋揭褐须x子強度和酶濃度對底物硫代乙酰膽堿及抑制劑PO在所得AChEads/Au電極上響應靈敏度的影響，實驗結果表明吸附液中高離子強度和較低的酶濃度更有利于得到對底物及對抑制劑同時具有靈敏響應的AChEads。在優(yōu)化條件下，AChEs和AChEad