羰基還原酶的半理性設(shè)計(jì)及其催化合成孟魯司特鈉-依折麥布中間體.pdf

1、孟魯司特鈉是治療哮喘的白三烯受體拮抗劑代表藥物，依折麥布是一種膽固醇吸收抑制劑，都具有良好的市場前景。近年來，利用生物催化劑不對稱還原前體酮合成手性醇成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本文利用計(jì)算機(jī)模擬確定突變位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上對一種對孟魯司特鈉手性中間體前體酮具有還原活性的羰基還原酶的改造進(jìn)行了研究;發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌對依折麥布手性醇具有不對稱還原合成活性。主要工作如下:
　　將對孟魯司特鈉手性中間體前體酮的具有還原活性的羰基還原酶(kred)基

2、因連接到pET22b質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒中，分別在大腸桿菌和畢赤酵母GS115進(jìn)行蛋白表達(dá)，使用粗酶液作為生物催化劑不對稱還原合成(S，E)-2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯與(S，E)-1-[3-[2-（7-氯-2-喹啉基）乙烯基]苯基]-3-[2-[2-羥基-2-基]苯基]丙-1-醇（孟魯司特鈉的兩個(gè)手性中間體），目標(biāo)產(chǎn)物ee值＞99％。
　　對kred進(jìn)行同源建模(swiss-m

3、odel)，應(yīng)用Discovery Studio2.5完成受體配體對接。分析輔酶及底物結(jié)合口袋，基于結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析，對酶分子進(jìn)行定點(diǎn)突變。發(fā)現(xiàn)209位點(diǎn)突變后，酶活提高了1.2倍。pET22b-kred(R209A)大腸桿菌重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白對2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯的活性是對2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯基-2-丙醇活性1.35倍，應(yīng)用Disco

4、very studio模擬突變酶與兩種底物的對接并計(jì)算能量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶與前者對接后能量較小，模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
　　發(fā)現(xiàn)大腸桿菌全細(xì)胞作為生物催化劑對依折麥布手性中間體前體酮具有不對稱還原活性，產(chǎn)物(4S)-3-[(5S)-5-（4-氟苯基）-5-羥基戊?；鵠-4-苯基-1，3-氧氮雜環(huán)戊烷-2-酮ee值為99.99％，轉(zhuǎn)化率為70％。對此全細(xì)胞反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳反應(yīng)溫度為35℃，最佳反應(yīng)的pH值為7，1m