甲基營養(yǎng)菌MB200與L-絲氨酸耐受性相關(guān)基因的克隆及其serA基因的初步研究.pdf

1、甲基營養(yǎng)菌被定義為“能夠利用包含一個或多個碳原子但不含碳碳鍵的低碳復(fù)合物生長的一類微生物”，它的代謝途徑特殊且應(yīng)用廣泛，因此研究該類菌的代謝與調(diào)節(jié)機制無論從理論上還是實際應(yīng)用上都具有重要的意義。
　　 實驗所用的菌株甲基營養(yǎng)菌MB200，能夠利用甲醇作為唯一能源和碳源生長且合成L-絲氨酸，但其對L-絲氨酸的耐受濃度較低，為15mg/mL。本工作擬篩選和研究與L-絲氨酸耐受性相關(guān)基因，為后續(xù)的代謝與調(diào)節(jié)機制研究提供基礎(chǔ)。實驗室的前

2、期工作中，已利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子pTnMod-RKm’成功構(gòu)建了甲基營養(yǎng)菌MB200的突變體庫，本實驗通過向培養(yǎng)基中添加L-絲氨酸的方法，以20mg/mL作為初始篩選濃度從突變體庫中共篩選到177株耐受L-絲氨酸的突變體。分別提取突變體的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHI隨機酶切后連接到載體pMD18-T上，導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，利用雙抗性（轉(zhuǎn)座子與T載體的抗性）在轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并酶切驗證后進一步測序，共從這1

3、77株突變體中成功克隆到了18個基因。分別對這18個基因進行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)從突變體S046中克隆到的基因serA與MethylobacteriumextorquensDM4的serA基因在核苷酸水平上有91％的一致性，與MethylobacteriumextorquensAM1的serA在氨基酸水平上有94％的相似性。該基因全長1，251bp，其編碼的3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH)催化磷酸化合成L-絲氨酸的第一步反應(yīng)，且在該酶

4、C末端存在有ACT功能域其上有L-絲氨酸結(jié)合位點。
　　 實驗進一步發(fā)現(xiàn)在甲基營養(yǎng)菌MB200中存在有PGDH酶活性，且該酶的酶活受L-絲氨酸的調(diào)控，當添加L-絲氨酸使其終濃度為40μM時PGDH酶活性降低了約44％，當繼續(xù)增加體系中L-絲氨酸的濃度發(fā)現(xiàn)酶活變化不大。后又通過表達載體pCM80分別構(gòu)建了serA基因及缺失了PGDH酶C末端ACT功能域后的serA△77基因過量表達的兩個重組體MB200/pCM80serA和MB2

5、00/pCM80serA△77，酶活檢測發(fā)現(xiàn)前者酶活受L-絲氨酸濃度影響較大，當L-絲氨酸濃度達到40μM時，其PGDH酶活降低了約33％；后者的PGDH酶活基本不變且對L-絲氨酸濃度變化不敏感。
　　 本工作還通過靜息細胞反應(yīng)體系的制備對這兩個重組菌及原始菌株進行了發(fā)酵產(chǎn)L-絲氨酸的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MB200/pCM80serA和MB200/pCM80ser△77的產(chǎn)量分別為13.6mg/mL及16.8mg/mL，較之原始菌株M